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松江鲈(Trachidermus fasciatus)是一种典型的降海洄游性鱼类,由于其味道鲜美而被誉为我国的四大名鱼之一,且具有极高的经济价值。历史上,松江鲈的分布范围较为广泛,可是随着环境压力的增大以及人为因素的影响,使其赖以生存的栖息地和繁殖地遭到严重破坏。现今,松江鲈已被列为国家Ⅱ级保护动物。为了使其自然种群得到恢复,建立自然保护区和进行人工养殖成为重要的途径和手段。而松江鲈人工养殖过程中严重的病害问题,成为了其发展的瓶颈。深入开展对松江鲈免疫机制的研究,以此为基础探索松江鲈疾病的防治是打破瓶颈的必经之路。血红素加氧酶作为生物体内重要的内源性保护蛋白质,除了能够催化降解血红素,避免游离血红素对机体的损伤；同时其活性的改变与组织抗炎、抗氧化、抗凋亡功能相关,其降解血红素得到的活性产物——CO、游离铁和胆绿素/胆红素也具有重要的生物学功能。本文采用RACE (Rapid amplification of cDNA ends)技术从松江鲈体内克隆得到了两种血红素加氧酶(TfHO-1和’TfHO-2)基因的cDNA全长,分析了它们的分子结构特征；采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)检测了两个基因的组织分布及重金属和LPS刺激后的表达模式变化；构建了它们的原核表达载体,实现了其在大肠杆菌中的重组表达；获得了它们的纯化蛋白,制备其多克隆抗体,并进行了蛋白活性检测。主要结果如下：TfHO-1的cDNA序列全长962bp,包括5’端非编码区98bp、3’端非编码区48bp,开放阅读框为816bp,编码272个氨基酸。预测分子量为32.13kD,理论等电点为6.40。第133-153位氨基酸为血红素加氧酶特征序列,在N端存在跨膜区,不含信号肽。氨基酸同源比对表明,松江鲈与其他已知鱼类的同源性为61.68%-76.84%,与哺乳类及其他物种的同源性为42.81%-46.69%。qRT-PCR检测发现,TfHO-1在各个组织均有表达。重金属和LPS刺激后TfHO-1表达存在明显上调。成功构建了TfHO-1的pET-30a(+)重组质粒,并转化Escherichia coli BL21(DE3)表达菌株,在37℃下,IPTG诱导4h后得到约为32kD左右重组蛋白,经检测目的蛋白以包涵体形式存在。由High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱进一步纯化,对纯化后的蛋白进行了TfHO-1酶活性检测,测得其比活为0.926nmolbilirubin/mg/h,不同pH和温度处理后发现其在pH7.4时和37℃时活力最大。TfHO-2的cDNA序列全长1149bp,包括5’端非编码区80bp,3’端非编码区247bp,开放阅读框822bp,编码274个氨基酸,预测分子量为36.15kD,理论等电点为5.79。第132-154位氨基酸为血红素加氧酶特征序列,在N端存在跨膜区,不含信号肽。氨基酸同源比对表明,松江鲈与其他已知鱼类的同源性均高于60%,与哺乳类及其他物种的同源性也在40%以上。qRT-PCR检测发现,TfHO-2在各组织中均有表达,但具有表达特异性。重金属刺激后,TfHO-2表达存在明显上调,表明TfHO-2可能参与到松江鲈机体对重金属的免疫防御中；LPS刺激后,TfHO-2在各检测的组织中,变化均不明显,表明LPS不能够诱导HO-2的活性。成功构建了TfHO-2的pET-30a(+)重组质粒,并转化E.coli BL21(DE3)表达菌株,在37℃下,IPTG诱导4h后,获得高表达量的约36kD的目的蛋白。经检测发现目的蛋白以包涵体形式存在。重组表达的粗蛋白经High-Affinity Ni-IDA Resin亲和柱进一步纯化。对纯化后的蛋白进行了TfHO-2酶活性检测,测得其比活为1.359nmol bilirubin/mg/h,不同pH和温度处理后发现其在pH7.4时和37℃时活力最大。