论文部分内容阅读
绿原酸（Chlorogenic acid,CGA）又称咖啡酰奎宁酸,化学名为3-O-咖啡酰奎宁酸,是咖啡酸和奎宁酸缩合而成的缩酚酸,广泛存在于各种植物中的苯基丙类化合物,是金银花、杜仲、咖啡、茵陈等许多中草药的主要活性成分之一。研究发现CGA具有清除自由基、抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及预防糖尿病、高血脂和肝炎等多种功能,因此CGA在食品、医药、日用化工等领域被广泛应用。目前CGA的生产主要是从中药植物细胞内提取,但是,由于中药植物生长周期长、资源匮乏、CGA含量低以及提取工艺复杂、成本高等问题,导致CGA生产效率较低。利用微生物发酵技术高效生产CGA,不仅可以减少对中药植物的依赖,而且会降低CGA的生产成本,是实现CGA高效生产的可行方案。本研究从金银花叶、红薯叶、薄荷叶、蒲公英叶和杜仲叶中分离筛选出具有合成CGA能力的内生菌,对所筛选出来的内生菌进行形态分析、分子鉴定以及发酵工艺优化,为开发产CGA工程菌株以及微生物发酵生产CGA奠定基础。主要研究内容如下:1.产CGA菌株的筛选:将金银花叶、红薯叶、薄荷叶、蒲公英叶和杜仲叶等植物样本在牛肉膏蛋白胨修饰培养基和马铃薯葡萄糖修饰培养基中进行培养,CGA是具有酚羟基的有机羧酸,修饰培养基中的Al3+可以通过与CGA的羟基结合,形成相对稳定的CGA-Al3+络合物,即在培养基中显示出红色,挑选修饰培养基中显色菌株进行发酵培养,然后通过高效液相色谱（HPLC）的方法对发酵产物进行分析,最终获得7株合成CGA的内生菌,其中5株内生细菌,2株内生真菌,内生细菌XJ-1的CGA产量最高,达到了9.9μg/m L,且为胞外产物。2.内生菌的形态分析及分子鉴定:分别使用扫描电子显微镜和光学显微镜观察产CGA较高的内生细菌XJ-1菌体形态;结果表明该菌株呈杆状革兰氏阳性细菌,通过对该菌株的16S r DNA基因PCR扩增和National Center for Biotechnology Information（NCBI）序列比对,结果表明:该内生菌株是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。并利用MEGA7.0软件构建了系统发育树。3.发酵条件的单因素优化:考察了碳源（蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖）、氮源（蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、柠檬酸）、碳氮比、无机盐（磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铜、硫酸亚铁、氯化钙、硫酸镁）、温度、p H、转速、装液量和接种量对CGA产量的影响,结果表明:该菌株合成CGA最好的碳源是果糖,在果糖30 g/L时,CGA的产量较高,能达到7.39μg/m L,但是该菌株利用其它碳源合成CGA的能力较差;不同有机和无机氮源对该菌株合成CGA有影响较大,在蛋白胨6 g/L、牛肉膏6 g/L、玉米浆5 g/L、硫酸铵4 g/L、氯化铵6 g/L、柠檬酸铵5 g/L时,CGA的产量均在单因素条件下达到最高,分别为11.02μg/m L、10.7μg/m L、14.9μg/m L、2.35μg/m L、2.02μg/m L、19.32μg/m L,其中最优有机氮源为蛋白胨（6g/L）,最优无机氮源为柠檬酸铵（5 g/L）;碳氮比研究发现,在碳氮比为1:4时,CGA产量较高,能达到38.21μg/m L;无机盐该菌株合成CGA有影响较大,在磷酸二氢钾1.5 g/L、磷酸氢二钾1.5 g/L、氯化钠3 g/L、硫酸铜0.03 g/L、硫酸亚铁0.15 g/L、氯化钙0.3 g/L、硫酸镁0.2 g/L时,CGA的产量均在单因素条件下达到最高,分别为9.08μg/m L、9.81μg/m L、6.39μg/m L、10.89μg/m L、6.26μg/m L、6.12μg/m L、6.05μg/m L;发酵培养基初始p H、培养温度、装液量、转速和接种量的单因素优化结果表明,在p H为5.0、37℃、装液量为20 m L、转速为220 rpm、接种量为10%时,CGA产量分别能达到16.22μg/m L、18.36μg/m L、20.35μg/m L、11.37μg/m L和10.83μg/m L。发酵条件的正交和响应面试验优化,正交实验结果表明:在果糖30 g/L、玉米浆6 g/L和柠檬酸铵5 g/L培养时CGA产量最高,CGA的产量达到了24.02μg/m L;最陡爬坡结果表明所建立的模型具有显著性（p值为0.0144）,果糖和p H（p＜0.05）对CGA合成具有显著性的影响;柠檬酸铵、玉米浆、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铜、氯化钙（p＞0.05）对CGA合成不具有显著性影响;响应面试验设计的试验结果表明,所建立的模型具有显著性（p值为＜0.0001）,果糖和p H对CGA产量的影响具有交互作用（p值为0.0015）。最终确定的最佳发酵条件为:果糖40 g/L、柠檬酸铵5 g/L、玉米浆6 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、硫酸镁0.15 g/L、硫酸铜0.03 g/L、氯化钙0.4 g/L、氯化钠1 g/L,发酵初始p H 6.0。在此条件下,响应面模型预测CGA的产量能达到79.03μg/m L,摇瓶验证CGA产量为75.82μg/m L,与预测结果相似,表明建立的数学模型准确。优化后CGA的产量是优化前的7.66倍。