脑是高度分化的器官,有较高的能量需求。线粒体通过氧化磷酸化产生能量供给体ATP,为神经元实现动作电位的传导和神经递质的释放提供足够的能量,保障脑的正常功能活动。衰老过程中,线粒体氧化磷酸化能力减弱、ATP的合成减少、活性氧增多、大分子物质的氧化损伤增强。同时,线粒体复合物I、II、III和IV的电子传递能力降低,线粒体膜电位下降。线粒体功能障碍可诱发氧化应激并损伤神经元功能状态,是衰老及相关神经退行性病变如阿尔茨海默病和帕金森病发病的关键因子。因此,维持正常的线粒体功能对于延缓衰老和降低年龄相关神经退行性疾病的风险至关重要。多种机制参与维持线粒体正常功能,包括通过线粒体生物发生保持线粒体质量,通过线粒体自噬清除受损的线粒体,以及通过线粒体动力学优化能量效率。但是,异常的线粒体生物发生和线粒体自噬会破坏线粒体稳态,并导致线粒体功能障碍及细胞功能损伤。因此,发现并探究改善衰老过程中线粒体功能障碍的有效办法,是目前亟待解决的问题。男性血清睾酮（testosterone,T）浓度在30岁左右达到峰值后逐渐下降,并且这种下降与阿尔茨海默病和帕金森病等与年龄相关的神经退行性疾病的发生与发展有关。老年男性帕金森病患者的发病率明显高于老年女性;男性阿尔茨海默病患者的症状可因T缺乏而加重,暗示T在神经退行性疾病中的潜在作用。尽管研究显示补充T可改善男性阿尔茨海默病患者的认知功能,缓解帕金森病的运动和非运动症状,但尚不清楚T是否通过改善线粒体功能障碍预防或治疗神经退行性变。研究表明,T可以通过基因组和非基因组信号通路调控神经元的生长、分化、生存或死亡。在经典的基因组通路中,雄激素受体与靶基因启动子中特定的DNA反应元件结合,调控mRNA的转录和蛋白质的合成。在原代培养的神经元中,生理浓度的T可以通过AR直接诱导神经保护作用。H2O2诱导的氧化应激使骨骼肌细胞的线粒体基因表达降低,而补充T可提高线粒体基因和核编码的线粒体生物发生相关基因的表达,并可能通过AR直接调控线粒体转录。因此,T可能通过AR调控线粒体相关基因的表达,改善脑衰老过程中的线粒体功能障碍。本研究通过分析T对老年雄性大鼠脑和氧化应激状态下的SH-SY5Y细胞的神经元功能状态、氧化应激水平及线粒体功能的影响,研究T调节神经元的线粒体生物发生的可能机制,以探寻预防或治疗衰老相关的神经退行性疾病的关键分子及相关信号通路。第一部分睾酮减轻氧化损伤对老年雄性大鼠脑的影响目的:观察T对老年雄性大鼠脑神经元功能状态及氧化应激水平的影响。方法:1.雄性SD大鼠分成3组:成年6月龄（6Mon）组、老年24月龄（24Mon）组和24月龄给予丙酸睾酮（testosterone propionate,TP,24Mon-TP）组。2.用旷场实验、圆筒实验和楔形板行走实验检测动物探索行为与协调运动行为。3.免疫组化和苏木精-伊红染色检测黑质中酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白以及海马中3-硝基酪氨酸的免疫反应的平均光密度和海马CA1区神经元核固缩数。4.分光光度法检测黑质和海马的氧化应激参数MDA、GSH、GSSG、GSH-PX、CAT、Cu Zn-SOD和Mn-SOD的水平。5.Western Blot检测黑质中酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白的表达,以及黑质和海马中GSH-PX、CAT和Mn-SOD的蛋白表达。6.qPCR定量黑质和海马中GSH-PX、CAT和Mn-SOD的mRNA表达。5.采用T放射免疫分析试剂盒进行血清T水平测定。结果:1.24Mon组血清T水平明显低于6Mon组和24Mon-TP组（P＜0.01）。2.与6Mon组相比,24Mon组探索行为如行走、攀爬、站立（校正P＜0.0167）和嗅探（P＜0.01）活动显著减少。与24Mon组相比,24Mon-TP组攀爬、站立（校正P＜0.0167）和嗅探（P＜0.01）行为显著增加。3.在圆筒实验中,24Mon组双前肢触壁次数低于6Mon组（校正P＜0.0167）,24Mon-TP组双前肢触壁次数高于24Mon组（校正P＜0.0167）。24Mon组双侧后肢楔形板行走测试失误得分均高于6Mon组（P＜0.01）,而24Mon-TP组的失误得分低于24Mon组（P＜0.01）。4.Western Blot及免疫组化结果显示,24Mon组黑质酪氨酸羟化酶和多巴胺转运蛋白表达水平低于6Mon组（P＜0.05）,而24Mon-TP组明显高于24Mon组（P＜0.05）。5.苏木精-伊红染色显示,6Mon组的海马CA1区锥体层,显示神经元的核大而清晰,24Mon组部分CA1神经元可见明显的核固缩。24Mon-TP组CA1样本的核固缩明显减少（校正P＜0.0167）。6.免疫组化结果显示,24Mon组海马中3-硝基酪氨酸的表达明显高于6Mon和24-Mon-TP组（校正P＜0.0167）。7.与6Mon组相比,24Mon组黑质和海马的MDA水平显著升高（P＜0.01）;补充TP后老年大鼠两个脑区MDA水平均显著降低（黑质:P＜0.01;海马:P＜0.05）。8.与6Mon组相比,24Mon组黑质和海马中GSH/GSSG比值以及GSH-PX、CAT和Mn-SOD活性均显著降低（P＜0.01）;与24Mon组相比,24Mon-TP组黑质和海马中这些指标均显著升高（P＜0.05）,GSH-PX、CAT和Mn-SOD的mRNA和蛋白表达水平也显著上调（P＜0.05）。小结:1.补充TP提高老年雄性大鼠血清T水平。2.补充TP改善老年雄性大鼠探索行为障碍及协调运动行为障碍。3.补充TP改善老年雄性大鼠脑的神经元功能状态。4.补充TP增强老年雄性大鼠黑质和海马的抗氧化能力。第二部分睾酮通过促进线粒体生物发生改善老年雄性大鼠脑线粒体功能目的:探讨T对雄性大鼠年龄相关的脑线粒体功能障碍的影响。方法:1.实验分组同第一部分。2.分光光度法检测黑质和海马ATP含量、柠檬酸合酶和线粒体复合物I-V酶活性。3.流式细胞术检测黑质和海马线粒体膜电位。4.qPCR定量黑质和海马PGC-1α、NRF-1、TFAM、ND1、COX1、ATP6和AMPK的mRNA表达及线粒体DNA拷贝数。5.Western Blot分析黑质和海马PGC-1α、NRF-1、TFAM、ND1、COX1、ATP6、AMPK和p-AMPK的蛋白表达。结果:1.与6Mon组相比,24Mon组黑质和海马细胞中线粒体膜电位降低（P＜0.01）,补充TP使老年大鼠黑质和海马细胞中线粒体膜电位升高（P＜0.05）。2.24Mon组黑质（校正P＜0.0167）和海马（P＜0.01）的ATP水平较6Mon组下降,补充TP提高了老年大鼠黑质（校正P＜0.0167）和海马（P＜0.01）的ATP水平。3.与6Mon组相比,24Mon组中黑质的复合物I和V活性（P＜0.01）以及海马的复合物V活性（校正P＜0.0167）降低,补充TP提高了24Mon-TP组中黑质的复合物I（P＜0.01）和V（P＜0.05）活性以及海马的复合物V活性（校正P＜0.0167）。4.与6Mon和24Mon-TP组相比,24Mon组黑质和海马的线粒体生物发生相关基因PGC-1α、NRF-1和TFAM的mRNA和蛋白水平较低（P＜0.05）。5.与6Mon组相比,24Mon组黑质和海马的柠檬酸合酶活性和线粒体DNA拷贝数降低（P＜0.01）。相反,在24Mon-TP组中,这两个变量在两个脑区都提高（P＜0.05）。同样,与24Mon组相比,在24Mon-TP组的黑质和海马检测到ND1、COX1和ATP6表达增加（P＜0.05）。6.与6Mon组相比,24Mon组黑质和海马的AMPK的mRNA水平降低（P＜0.01）。24Mon-TP组黑质（P＜0.01）和海马（P＜0.05）AMPK的mRNA水平较24Mon组升高,两脑区的p-AMPK/AMPK比值也升高（P＜0.01）。小结:1.补充TP提高老年雄性大鼠黑质和海马线粒体膜电位、ATP含量和线粒体复合物酶活性,改善线粒体功能障碍。2.补充TP使老年雄性大鼠黑质和海马线粒体生物发生得到改善。3.补充TP增加老年雄性大鼠黑质和海马线粒体的含量。4.补充TP激活老年雄性大鼠脑AMPK通路。第三部分睾酮通过AMPK及TFAM促进线粒体生物发生目的:探讨T调节线粒体生物发生的可能通路及在TFAM基因上的作用位点。方法:1.人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,给予不同浓度T和H2O2以及雄激素受体拮抗剂氟他胺（flutamide,F）、AMPK抑制剂或TFAM基因小RNA干扰（small RNA interference,si RNA）的处理。2.分光光度法检测细胞活力、氧化应激参数GSH/GSSG、ATP含量及柠檬酸合酶活性。3.使用Seahorse Bioscience XF24 Analyser检测细胞的氧消耗速率,分析线粒体基础呼吸功能、ATP生成、最大呼吸和备用呼吸能力。4.通过JC-1和Mito Tracker Red CMXRos染色,并用共聚焦显微镜观察,分析线粒体膜电位、线粒体质量及线粒体碎片化。5.qPCR定量细胞PGC-1α、NRF-1、TFAM、ND1、COX1和ATP6、的mRNA表达及线粒体DNA拷贝数。6.Western Blot分析3-NT、PGC-1α、TFAM、AMPK和p-AMPK的蛋白表达。7.通过si RNA转染技术沉默TFAM si RNA转染（si-TFAM）组TFAM基因,并设立si RNA阴性对照（NC）组。8.ChIP-qPCR验证TFAM基因启动子区的雄激素受体结合位点。结果:1.10nM T预处理24h+200μM H2O224h处理组较单独200μM H2O224h处理组,细胞活力明显上升（P＜0.01）。在T预处理前1h给予10μM雄激素受体拮抗剂F,抑制了10n M T对200μM H2O2诱导的SH-SY5Y细胞活力降低的改善作用（P＜0.01）。2.与对照组相比,H2O2处理组GSH下降,GSSG上升及GSH/GSSG比值降低（P＜0.01）。T预处理提高了GSH（P＜0.01）,降低了GSSG（P＜0.01）,并使GSH/GSSG的比值升高（P＜0.01）,但在T预处理前给予F,抑制了T预处理对GSH、GSSG及GSH/GSSG比值的影响（P＜0.01）。3.与对照组相比,H2O2处理组氧化应激的生物标志物3-NT的蛋白表达提高（P＜0.01）。T预处理减少了3-NT的表达（P＜0.01）,然而在T预处理前给予F,抑制了T预处理对3-NT表达的减少作用（P＜0.01）。4.H2O2处理组基础呼吸功能、ATP生成、最大呼吸和备用呼吸能力比对照组低（P＜0.01）。T预处理使基础呼吸功能、ATP生成、最大呼吸和备用呼吸能力较H2O2处理组提高（P＜0.01）。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对H2O2导致的线粒体生物能缺陷的改善作用（P＜0.01）。5.与对照组相比,H2O2处理组的线粒体膜电位降低（P＜0.05）。T预处理使H2O2处理后的膜电位上升（P＜0.05）,并达到对照组水平。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对H2O2导致的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位去极化的改善作用（P＜0.01）。6.与对照组相比,H2O2处理组的ATP含量下降（P＜0.01）。在H2O2处理前给予T预处理使ATP含量提高（P＜0.01）。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对H2O2导致的SH-SY5Y细胞ATP含量降低的改善作用（P＜0.01）。7.H2O2处理组的线粒体质量比对照组显著降低（P＜0.01）,在H2O2处理前给予T预处理提高了线粒体质量（P＜0.05）。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对H2O2导致的SH-SY5Y细胞线粒体质量减少的提高作用（P＜0.05）。8.H2O2处理使线粒体拷贝数下降（P＜0.01）,T预处理提高线粒体拷贝数（P＜0.01）。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对H2O2导致的SH-SY5Y细胞线线粒体拷贝数降低的提高作用（P＜0.01）。9.H2O2处理组线粒体生物发生相关基因PGC-1α、NRF-1和TFAM的mRNA的表达水平比对照组显著降低（P＜0.01）。T预处理使以上基因的表达显著增加（P＜0.01）。在T预处理前给予F,削弱了T预处理对H2O2导致的SH-SY5Y细胞PGC-1α、NRF1和TFAM基因表达降低的提高作用（P＜0.05）。10.与对照组相比,H2O2处理组的线粒体动态学相关基因Drp1的mRNA的表达增加,Mfn1和Opa1的mRNA的表达减少（P＜0.01）。T预处理使H2O2处理后Drp1的mRNA降低,Mfn1和Opa1的mRNA增加（P＜0.01）。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对SH-SY5Y细胞降低Drp1（P＜0.01）和增加Mfn1（P＜0.01）、Opa1（P＜0.05）基因表达的作用。11.H2O2处理组线粒体碎片化的细胞数量比对照组多（P＜0.01）。T预处理使H2O2处理后线粒体碎片化的细胞数量下降（P＜0.05）。在T预处理前给予F,抑制了T预处理对SH-SY5Y细胞线粒体碎片化的减少作用（P＜0.05）。12.T预处理使H2O2处理后PGC-1α、NRF-1和TFAM的表达升高（P＜0.01）。在T预处理前给予AMPK特异性抑制剂,使PGC-1α、NRF-1和TFAM的表达较T+H2O2组下降（P＜0.05）,但未完全抑制T对线粒体生物发生相关基因的上调作用（P＜0.05）。13.与NC组比较,NC+T组线粒体膜电位提高（P＜0.01）。TFAM敲低后,si-TFAM组较NC组线粒体膜电位下降（P＜0.01）,si-TFAM+T组较NC+T组线粒体膜电位下降（P＜0.01）。14.与NC组相比,ATP水平在NC+T组上升（P＜0.05）,在si-TFAM组下降（P＜0.01）。si-TFAM+T组较NC+T组ATP水平下降（P＜0.01）。15.与NC组相比,柠檬酸合酶活性在NC+T组上升（P＜0.01）,在si-TFAM组下降（P＜0.01）。si-TFAM+T组较NC+T组柠檬酸合酶活性下降（P＜0.01）。16.与NC组比较,NC+T组线粒体DNA拷贝数提高（P＜0.01）。TFAM沉默后,si-TFAM与si-TFAM+T组较NC组线粒体DNA拷贝数下降（P＜0.01）,si-TFAM+T组较NC+T组线粒体DNA拷贝数下降（P＜0.01）。17.与NC组相比,线粒体基因ND1、COX1和ATP6的表达在NC+T组被上调（P＜0.01）,在si-TFAM组和si-TFAM+T组被下调（P＜0.05）。si-TFAM+T组较NC+T组ND1、COX1和ATP6的表达下调（P＜0.01）。18.预测在TFAM基因上的雄激素受体结合位点为上游启动子区1285-1299。Ch IP-qPCR结果显示,雄激素受体组特异性扩增高于Ig G组（P＜0.01）。琼脂糖凝胶电泳结果显示雄激素受体组的荧光条带较Ig G组亮。小结:1.T通过雄激素受体发挥对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤和细胞死亡的改善作用。2.T激活雄激素受体改善线粒体功能障碍。3.T促进线粒体生物发生及线粒体完整性呈雄激素受体依赖性4.AMPK特异性抑制剂阻断了AMPK信号通路的激活,同时削弱了T对线粒体生物发生相关基因的上调作用。5.沉默TFAM基因抑制T对线粒体生物发生和线粒体功能的促进作用。6.在TFAM启动子区存在雄激素受体结合位点。结论:1.睾酮激活AMPK-PGC-1α通路及其效应分子,提高TFAM的表达,进而促进线粒体生物发生。2.睾酮激活的雄激素受体直接与TFAM基因启动子区结合,促进线粒体生物发生。3.补充睾酮改善老年雄性大鼠的神经元功能状态,并通过增强线粒体抗氧化能力和线粒体生物发生,改善线粒体功能障碍。