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孤独症是一种主要特征为不同程度的社会交往障碍、言语发育障碍、兴趣狭窄和重复刻板行为的神经发育障碍疾病。目前认为遗传因素和环境因素是孤独症的重要发病原因。脆性X综合征（Fragile X syndrome,FXS）是孤独症最常见的单基因突变遗传致病因素,是由于脆性X智力低下基因1（Fragile X mental retardation gene 1,Fmr1）沉默导致脆性X智力低下蛋白（Fragile X mental retardation protein,FMRP）缺失所致。FMRP可以通过与mi RNA相互作用来调节突触蛋白的表达,引起树突发育障碍和认知功能缺陷。临床研究提示雄激素水平异常可能是孤独症患者大脑发育和行为障碍的原因。雄激素调控海马突触可塑性和神经行为是否由FMRP和mi RNA介导,目前尚不清楚。本研究将以小鼠海马神经元细胞系HT22细胞和2月龄雄性Fmr1基因敲除（Knockout,KO）小鼠和同窝野生型（Wild-type,WT）小鼠为研究模型,研究FMRP是否介导双氢睾酮（Dihydrotestosterone,DHT）调控海马神经元突触后致密蛋白95（Postsynaptic density 95,PSD95）的表达,并探讨其作用机制。第一部分FMRP介导DHT对HT22细胞突触蛋白PSD95表达的影响目的:以小鼠海马神经元细胞系HT22细胞作为研究对象,研究DHT对突触蛋白PSD95和FMRP的影响,观察FMRP与PSD95 m RNA的结合情况,验证敲降FMRP对PSD95蛋白的影响,并阐明FMRP是否参与DHT对PSD95蛋白表达的调控。方法:1.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验观察DHT对PSD95蛋白和FMRP表达水平的影响。2.通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）实验观察FMRP与PSD95 m RNA的结合情况。3.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验观察敲降FMRP对PSD95蛋白的影响。4.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验观察敲降FMRP后,DHT对PSD95蛋白表达的影响。结果:1.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,HT22细胞DHT组PSD95蛋白表达水平高于对照组,DHT组FMRP表达水平低于对照组。2.RIP实验结果显示,HT22细胞FMRP组对PSD95 m RNA的富集程度显著高于对照Ig G组。3.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,敲降HT22细胞FMRP后,PSD95蛋白表达水平升高。4.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,敲降HT22细胞FMRP增强了DHT对PSD95蛋白的上调作用。小结:1.DHT上调HT22细胞突触蛋白PSD95的表达,下调FMRP的表达。2.HT22细胞FMRP与PSD95 m RNA直接结合。3.敲降FMRP上调HT22细胞突触蛋白PSD95的表达。4.DHT通过下调FMRP,促进HT22细胞突触蛋白PSD95的表达。第二部分FMRP通过mi R-125a介导DHT对HT22细胞突触蛋白PSD95表达的影响目的:以小鼠海马神经元细胞系HT22细胞作为研究对象,研究DHT是否影响mi R-125a的表达水平,观察敲降mi R-125a对突触蛋白PSD95的影响,探究mi R-125a是否参与DHT以及FMRP对PSD95蛋白表达的调控,并探究FMRP和mi R-125a是否关联参与DHT对PSD95蛋白表达的调控。方法:1.通过定量逆转录-聚合酶链反应（quantificational reverse transcription-polymerase chain reaction,q RT-PCR）观察DHT对mi R-125a表达水平的影响。2.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验检测敲降mi R-125a对PSD95蛋白表达水平的影响。3.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验观察mi R-125a是否参与DHT对PSD95蛋白表达的调控。4.通过q RT-PCR实验观察FMRP对mi R-125a表达水平的影响。5.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验观察mi R-125a是否参与FMRP对PSD95蛋白表达的调控。6.通过免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验观察FMRP和mi R-125a是否关联参与DHT对PSD95蛋白表达的调控。结果:1.q RT-PCR实验结果显示,HT22细胞DHT组mi R-125a表达水平低于对照组。2.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,敲降HT22细胞mi R-125a后,突触蛋白PSD95表达水平升高。3.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,敲降HT22细胞mi R-125a,增强了DHT对PSD95的上调作用。4.q RT-PCR实验结果显示,敲降HT22细胞FMRP后,mi R-125a表达水平降低。5.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,敲降HT22细胞mi R-125a,增强了敲降FMRP对突触蛋白PSD95的上调作用。6.免疫荧光细胞化学染色和免疫印迹实验结果显示,敲降HT22细胞FMRP和mi R-125a,增强了DHT对突触蛋白PSD95的上调作用。小结:1.DHT下调HT22细胞mi R-125a的表达。2.敲降mi R-125a上调HT22细胞突触蛋白PSD95的表达。3.DHT通过下调mi R-125a,促进HT22细胞突触蛋白PSD95的表达。4.敲降FMRP通过下调mi R-125a,促进HT22细胞突触蛋白PSD95的表达。5.DHT通过下调FMRP,进而下调mi R-125a,促进HT22细胞突触蛋白PSD95的表达。第三部分DHT对Fmr1基因敲除小鼠孤独症样行为和海马突触可塑性的影响目的:以Fmr1 KO和同窝WT小鼠为研究对象,观察去势及去势后DHT补充治疗对小鼠孤独症样行为、海马树突棘和突触蛋白PSD95的影响,并观察敲降mi R-125a对PSD95蛋白表达水平的影响。方法:1.通过旷场实验检测去势及去势后DHT补充治疗对Fmr1 KO和WT小鼠焦虑状态的影响。2.通过三箱社交实验检测去势及去势后DHT补充治疗对Fmr1 KO和WT小鼠社交能力和社交新颖性偏好的影响。3.通过新物体识别和Morris水迷宫实验检测去势及去势后DHT补充治疗对Fmr1 KO和WT小鼠学习记忆的影响。4.通过强迫游泳实验检测去势及去势后DHT补充治疗对Fmr1 KO和WT小鼠抑郁状态的影响。5.通过Golgi-Cox染色实验检测去势及去势后DHT补充治疗对Fmr1 KO和WT小鼠海马神经元树突棘密度和成熟度的影响。6.敲降mi R-125a后,通过免疫组织化学和免疫印迹实验检测去势及去势后DHT补充治疗对Fmr1 KO和WT小鼠海马神经元突触蛋白PSD95表达的影响。结果:1.旷场实验结果显示,与WT小鼠相比,Fmr1 KO小鼠焦虑程度严重;去势加重了WT小鼠焦虑状态;去势后腹腔注射DHT补充治疗,逆转了WT小鼠的焦虑状态,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的焦虑状态并没有影响。2.三箱社交实验结果显示,与WT小鼠相比,Fmr1 KO小鼠社交新颖性偏好受损;去势损伤了WT小鼠社交能力和社交新颖性偏好;去势后腹腔注射DHT补充治疗,逆转了WT小鼠的社交能力和社交新颖性偏好,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的社交能力和社交新颖性偏好并没有影响。3.新物体识别和Morris水迷宫实验结果显示,与WT小鼠相比,Fmr1KO小鼠学习记忆受损;去势损伤了WT小鼠学习记忆;去势后腹腔注射DHT补充治疗,逆转了WT小鼠的学习记忆,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的学习记忆并没有影响。4.强迫游泳结果显示,与WT小鼠相比,Fmr1 KO小鼠抑郁程度严重;去势加重了WT小鼠抑郁状态;去势后腹腔注射DHT补充治疗,逆转了WT小鼠的抑郁状态,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的抑郁状态并没有影响。5.Golgi-Cox染色实验结果显示,与WT小鼠相比,Fmr1 KO小鼠树突棘密度增加,蘑菇型树突棘密度降低,细长型树突棘密度增加,粗短型树突棘密度不变;去势后WT小鼠海马神经元树突棘密度降低,蘑菇型和细长型树突棘密度降低,粗短型树突棘密度不变;去势后腹腔注射DHT补充治疗,逆转了WT小鼠海马神经元树突棘的改变,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的树突棘没有影响。6.免疫组织化学染色和免疫印迹实验结果显示,与WT小鼠相比,Fmr1 KO小鼠海马神经元突触蛋白PSD95增加;去势后WT小鼠海马神经元突触蛋白PSD95下调;去势后腹腔注射DHT补充治疗,逆转WT小鼠的PSD95蛋白的改变,而雄激素对Fmr1 KO小鼠海马神经元的PSD95蛋白没有影响;敲降mi R-125a后,Fmr1 KO和WT小鼠海马神经元PSD95蛋白升高。小结:1.去势加重了WT小鼠焦虑、抑郁状态,损伤了学习记忆和社交能力;去势后DHT补充治疗,逆转了WT小鼠的行为学障碍,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的神经行为并没有影响。2.去势后WT小鼠海马神经元树突棘密度降低,蘑菇型和细长型树突棘密度降低,粗短型树突棘密度不变;去势后DHT补充治疗,逆转了WT小鼠海马神经元树突棘的改变,而雄激素对Fmr1 KO小鼠的树突棘没有影响。3.去势后WT小鼠海马神经元突触蛋白PSD95下调;去势后DHT补充治疗,逆转WT小鼠的PSD95蛋白的改变,而雄激素对Fmr1 KO小鼠海马神经元的PSD95蛋白没有影响;敲降mi R-125a后,Fmr1 KO和WT小鼠海马神经元PSD95蛋白升高。