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动脉粥样硬化引发的心脑血管疾病在我国是病残和死亡的主要原因之一。动脉粥样硬化可以累及所有的大型和中型动脉,包括冠状动脉、颈动脉和脑动脉,主动脉及其分支,以及四肢的主要动脉。研究动脉粥样硬化发病的细胞和分子机制,对发展新的动脉粥样硬化的预防和治疗方法具有极为重要的意义。现今对粥样硬化的治疗主要集中在改善血脂代谢、调整生活方式、抗血小板、改善血管状况、控制其它基础疾病等方面。但研究表明炎性反应是粥样硬化病变中的重要病理变化,炎性反应参与了粥样硬化病变的全部过程,对斑块发生、进展、破裂等有重要的调控作用。巨噬细胞、淋巴细胞、细胞因子等在上述反应过程中扮演了重要角色。脂质代谢失衡和巨噬细胞介导的免疫功能失调是动脉粥样硬化的主要病理学特征。低密度脂蛋白(LDL),尤其是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),是动脉粥样硬化病变局部脂质积累的主要来源。动脉粥样硬化病变早期主要特征是循环血液中的脂蛋白渗透并聚集在主动脉血管壁内膜下,之后血液中的单核细胞会被招募并迁移至粥样硬化病变处转化为巨噬细胞并吞噬病变局部的脂蛋白,巨噬细胞胞质中过多的胆固醇酯积累会导致胆固醇结晶的形成,最终巨噬细胞形成泡沫细胞,上述病理变化会激活NLRP3炎性小体、诱导内质网应激反应、激活炎性反应信号通路从而引发炎性反应。因此深入了解巨噬细胞在动脉粥样硬化中活化调控的分子机制是非常重要的。现有研究表明调控巨噬细胞对炎性小体活化及其他炎性信号通路的激活是一种潜在的非常有研究前景的动脉粥样硬化治疗和预防策略。SESNs是一类调节多种细胞代谢稳态的应激诱导蛋白。越来越多的证据表明,内源性sestrin蛋白的缺乏会引发一系列代谢紊乱,包括胰岛素抵抗、脂肪堆积、线粒体功能障碍和氧化损伤。在sestrin蛋白中,SESN2的作用已经得到了深入的研究。SESN2已经被证明可以调控胞内LKB1-AMPK信号通路来激活心肌细胞中的AMPK信号通路。在巨噬细胞RAW264.7系中,SESN2对炎症反应包括一氧化氮的释放、诱导型一氧化氮合酶的表达以及经典促炎细胞因子的分泌有明显的抑制作用。但是SESN1的表达模式与功能特点仍旧不明确。与SESN2类似,SESN1是p53的靶基因,其产物是一种抗氧化剂,可以激活AMPK信号通路,同时抑制mTORC1。SESN1被认为是控制mTORC1活性的滤泡性淋巴瘤的肿瘤抑制剂。此外,SESN1作为亮氨酸传感器,是骨骼肌中mTORC1依赖亮氨酸激活所必需的。人体衰老CD4+T细胞表达SESN1、SESN2和SESN3。对衰老T细胞SESN1、SESN2和SESN3的抑制可引起衰老T细胞的功能逆转。据我们所知,SESN1在动脉粥样硬化或巨噬细胞中的作用尚未阐明。目的:本研究旨在探讨sestrin1蛋白在粥样硬化小鼠巨噬细胞中对ox-LDL诱导的NLRP3炎性小体激活的调控作用。阐明sestrin1在巨噬细胞中的表达及其调控NLRP3的机制,明确sestrin1对粥样硬化病变的调控作用及潜在分子机制,为粥样硬化的治疗提供一种基于控制炎性反应的理论策略。方法:利用ApoE-/-小鼠建立粥样硬化模型,野生型C57BL/6J小鼠正常喂养,行以下实验室检测与操作。1.sestrin1蛋白在粥样硬化小鼠主动脉巨噬细胞与单核细胞中的表达水平研究。提取、分离两种小鼠主动脉中的单核细胞与巨噬细胞,利用流式技术与RT-PCR技术测量两种小鼠单核细胞与巨噬细胞含量及sestrin1、sestrin2、sestrin3蛋白mRNA表达水平;2.慢病毒转染巨噬细胞的研究。利用LS1与LC两种慢病毒载体独立转染C57BL/6J小鼠巨噬细胞,转染后检测被转染巨噬细胞内NLRP3、NLRC4炎性小体蛋白、sesrein1、IL-1β及凋亡蛋白酶caspase-1水平并与未经转染处理的巨噬细胞进行对比。检测LS1转染巨噬细胞中sestrin1蛋白各亚型含量;3.检测sestrin1蛋白对NLRP3炎性小体激活的影响。经LPS和ox-LDL处理C57BL/6J小鼠巨噬细胞,检测sestrin1,sestrin2蛋白水平。后经上述两种慢病毒分别独立处理该巨噬细胞,检测两种不同慢病毒处理后ACS与NLRP3炎性小体之间的结合水平、Caspase-1 p20、IL-1β、pro-IL-1 β、IL-18表达水平,检测未经ox-LDL处理的巨噬细胞内NLRP3炎性小体含量;4.检测sestrin1蛋白对NF-κB信号通路的作用研究。C57BL/6J小鼠巨噬细胞经上述两种慢病毒独立处理后分为两组,两组巨噬细胞部分ox-LDL处理,部分未经进一步处理后分为4组,检测各组巨噬细胞IL-1α、IL-6、IL-1β、IKKβ磷酸化、NF-κB p50及p65、IκBα水平;5.sestrin1蛋白对胆固醇结晶诱导的NLRP3炎性小体活化的作用研究。C57BL/6J小鼠巨噬细胞经两种慢病毒独立处理后分两组,经 CHC 与 LPS 处理后分别检测 IL-1β、Caspase-1 p20、pro-Caspase-1 水平及 ACS与NLRP3之间结合水平,检测与巨噬细胞对脂质摄取相关受体表达水平;6.高达表sestrin1蛋白水平对巨噬细胞介导的炎性反应的作用研究。清除ApoE-/-小鼠固有单核细胞与巨噬细胞,两种慢病毒独立处理的巨噬细胞分别过继输注小鼠体内,2周后对比小鼠主动脉巨噬细胞水平,并检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL1水平。7.敲低sestrin1蛋白水平对巨噬细胞介导的炎性反应的作用研究。利用含针对sestrin1蛋白sh-RNA的慢病毒,同6中的操作,检测IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平,并与不含sestrin1蛋白shRNA慢病毒转染的小鼠进行对比。结果:1.sestrin1蛋白在粥样硬化小鼠主动脉巨噬细胞中表达上调1.1 C57BL/6J小鼠与ApoE-/-粥样硬化小鼠主动脉中均存在髓细胞。1.2与C57BL/6J小鼠相比单核细胞在ApoE-/-粥样硬化小鼠主动脉中含量显著升高。1.3与C57BL/6J小鼠相比,sestrin1蛋白mRNA表达水平在ApoE-/-小鼠主动脉巨噬细胞中显著升高,具有统计学差异(P<0.001),在单核细胞中适度升高,具有统计学差异(P<0.05)。1.4与C57BL/6J小鼠相比,sestrin2蛋白mRNA表达水平在ApoE-/-小鼠主动脉巨噬细胞中显著升高,具有统计学差异(P<0.01),在单核细胞中无明显差异(P>0.05)。1.5与C57BL/6J小鼠相比,sestrin3蛋白mRNA表达水平在ApoE-/-小鼠主动脉巨噬细胞与单核细胞中均无明显差异(P>0.05)。2.体外慢病毒转染C57BL/6J小鼠巨噬细胞诱导sestrin1蛋白过表达2.1与LC慢病毒转染的巨噬细胞相比,LS1慢病毒转染巨噬细胞中sestrin1蛋白水平明显提高,sestrin2和sestrin3水平无变化,转染表达成功。2.2与C57BL/6J小鼠巨噬细胞相比,LC、LS1两种慢病毒转染后的巨噬细胞中的NLRP3、NLRC4表达水平均升高,与未转染巨噬细胞相比具有统计学差异(P<0.05)。两种被转染巨噬细胞之间比较无明显差异(P>0.05)。2.3在两种慢病毒转染的巨噬细胞中均未检测到IL-1β表达。2.4在两种慢病毒转染的巨噬细胞中均未明显检测到Caspase-1 p20表达,pro-Caspase-1蛋白在三种巨噬细胞之间对比无明显差异。3.sestrin1蛋白抑制了 ox-LDL诱导的C57BL/6J小鼠巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化3.1 LPS与ox-LDL处理后,分析显示与未经处理巨噬细胞相比,sestrin1在经处理过后的巨噬细胞中的表达水平无明显差异。3.2 sestrin2在处理后的巨噬细胞中表达上调。3.3在LS1慢病毒转染的巨噬细胞中ASC与NLRP3结合情况明显弱于LC慢病毒转染的巨噬细胞,具有统计学差异(P<0.01)。3.4 pro-caspase-1在两种慢病毒转染后的巨噬细胞中表达无明显差异(P>0.05),Caspase-1 p20在LS1慢病毒转染的巨噬细胞中含量明显低于LC慢病毒转染的巨噬细胞,具有统计学差异(P<0.05)。3.5在LS1慢病毒转染的巨噬细胞中成熟IL-1β水平明显低于LC慢病毒转染的巨噬细胞,具有统计学差异(P<0.05),但IL-1β mRNA水平在两者之间对比无统计学差异(P>0.05)。3.6在两种经不同慢病毒处理的巨噬细胞中pro-IL-1β水平无明显差异(P>0.05),但IL-1β表达水平具有明显差异,具有统计学意义(P<0.05)。3.7 IL-18 mRNA水平在两种慢病毒处理后的巨噬细胞中无统计学差异(P>0.05)。4.sestrin1蛋白抑制了 ox-LDL诱导了 NF-κB炎性信号通路激活4.1单纯ox-LDL处理巨噬细胞后,IL-1α、IL-6、IL-1β的mRNA均明显升高,与无处理的巨噬细胞相比有统计学差异(IL-1β:P<0.001,IL-6:P<0.05,IL-1α:P<0.01)。LS1慢病毒转染ox-LDL处理的巨噬细胞中IL-6、IL-1β的mRNA水平低于LC慢病毒转染的巨噬细胞(IL-1β:P<0.01,IL-6:P<0.05)。4.2 ox-LDL诱导IKKβ的活化,LS1慢病毒转染后IKKβ的活化明显减弱,与LC慢病毒转染巨噬细胞相比具有统计学差异(P<0.05)。4.3 ox-LDL抑制IκBα活化,增加了 NF-κB p50与p65因子表达水平,LS1慢病毒转染ox-LDL处理的巨噬细胞中,IκBα活化增强,NF-κB p50与p65因子表达水平下降(IκBα:P<0.05,p50:P<0.01,p65:P<0.05)。5.sestrin1抑制胆固醇晶体诱导的NLRP3炎性小体活化5.1 IL-1β在LC慢病毒转染的巨噬细胞中的水平高于LS1慢病毒转染的巨噬细胞,具有统计学差异(P<0.001)。5.2 Caspase-1 p20及ACS与NLRP3结合水平在LS1慢病毒转染的巨噬细胞中低于LC慢病毒转染的巨噬细胞,具有统计学差异(P<0.05)。5.3 LS1慢病毒转染的巨噬细胞中脂质沉积更少,泡沫细胞数量减少。5.4与LC慢病毒转染的巨噬细胞相比,LS1慢病毒转染的巨噬细胞中脂质受体表达量无差异,无统计学意义(P>0.05)。6.高表达sestrin1蛋白改善了巨噬细胞介导的粥样硬化小鼠主动脉局部炎性反应。与输注LC慢病毒转染的巨噬细胞的小鼠相比,IL-1β、IL-1β mRNA、IL-6、TNF-α、CXCL1在输注LS1慢病毒转染的巨噬细胞的小鼠主动脉局部表达水平降低,具有统计学差异(IL-6:P<0.01,TNF-α:P<0.001,IL-1β:P<0.001,IL-1βmRNA:P<0.05,CXCL1:P<0.01)。7.低表达sestrin1蛋白促进了巨噬细胞介导的粥样硬化小鼠主动脉局部炎性反应7.1与输注shC转染的巨噬细胞的小鼠相比,Caspase-1在输注shS1转染的巨噬细胞的小鼠中的活化水平明显升高,具有统计学差异(P<0.01)。7.2与输注shC转染的巨噬细胞的小鼠相比,IL-1β、IL-6、TNF-α在输注shS1转染的小鼠巨噬细胞中的表达水平明显升高,具有统计学差异(IL-6:P<0.001,TNF-α:P<0.001,IL-1 β:P<0.05)。7.3与输注shC转染的巨噬细胞的小鼠相比,TNF-α在输注shS1转染巨噬细胞的小鼠主动脉局部中的表达水平升高,具有统计学差异(P<0.05)。结论:1.粥样硬化小鼠主动脉局部单核细胞含量升高,表明病变局部单核细胞的招募和内膜下浸润增强,这符合粥样硬化病变的基本病理过程。Sestrin1与sestrin2水平在主动脉巨噬细胞中均升高证明这两种蛋白在粥样硬化中均起到了调控炎性反应的作用,sestrin2被认为具有抑制炎性反应功能,sestrin1在控制炎性反应方面与sestrin2有类似功能,而sestrin3目前对粥样硬化炎性反应的作用尚不明确。而在C57BL/6J小鼠中sestrin1水平明显低于粥样硬化小鼠,表明在粥样硬化炎性反应中sestrin1蛋白表达水平被上调。本研究尚未明确该调控机制。2.sestrin1蛋白水平在LS1转染的C57BL/6J小鼠巨噬细胞中表达水平升高,证明转染成功。但LC与LS1转染后的巨噬细胞中NLRP3与NRRC4炎性小体表达水平均升高,说明慢病毒本身会造成炎性小体表达水平的升高,这是后续检验sestrin1对粥样硬化炎性小体表达水平调控的基础。而与炎性反应直接相关的因子IL-1β、Caspase-1 p20等在两种被转染巨噬细胞中均未检测到,pro-Caspase-1 p20在两组巨噬细胞中表达水平无差异,说明炎症途径在两种慢病毒转染的巨噬细胞中均未被激活。Sestrin1分型显示1型在调控巨噬细胞介导的炎性反应中占据主导地位。3.sestrin1蛋白抑制了 ox-LDL诱导的C57BL/6J小鼠巨噬细胞NLRP3炎性小体的活化。LPS与ox-LDL处理后,sestrin1蛋白水平无明显变化,但sestrin2蛋白水平升高,这与先前的研究结果相一致,sestrin2作为抗氧化物质在氧化损伤或者炎症情况下表达上调。在sestrin1蛋白表达情况下,ACS与NLRP3结合水平显著被抑制,促炎因子IL-1β与Caspase-1 p20表达水平下降,说明sestrin1对ox-LDL诱导的NLRP3活化有显著的抑制作用。但sestrin1蛋白在LPS处理的巨噬细胞中也表现出对NLRP3炎性小体抑制的作用,说明sestrin1抑制NLRP3不是ox-LDL特异性依赖的。4.sestrin1蛋白抑制了 ox-LDL诱导了 NF-κB炎性信号通路激活。单独利用ox-LDL处理巨噬细胞后,炎性因子IL-1α、IL-6、IL-1β的mRNA均明显升高,NF-κB p50与p65因子表达水平升高,结合IKKβ的磷酸化与IκBα的抑制效果,说明ox-LDL确定可以引起炎性通路活化。而以上促炎作用在sestrin1蛋白存在情况下均得以改善。说明sestrin1蛋白确定可以抑制ox-LDL诱导的NF-κB炎性信号通路激活。5.sestrin1抑制胆固醇晶体诱导的NLRP3炎性小体活化。胆固醇结晶处理后的巨噬细胞中IL-1β、Caspase-1 p20、ACS与NLRP3结合水平明显升高,而在sestrin1蛋白表达情况下,则显著抑制了上述病理过程。而且油红O染色表明在sestrin1蛋白存在情况下病变处泡沫细胞减少,巨噬细胞内脂质沉积得到改善,作为粥样硬化重要病理变化,sestrin1蛋白起到了很好的预防作用,但巨噬细胞表面脂质受体水平并未明显改变。需要进一步研究明确沫细胞数量减少的原因。6.改变小鼠体内sestrin1蛋白表达水平可调控粥样硬化病变炎性反应。如结果6和7中的内容所示,高表达sestrin1蛋白的小鼠主动脉内IL-1β、IL-1β mRNA、IL-6、TNF-α、CXCL1表达水平明显降低,与LC慢病毒转染小鼠相比差异明显。在敲除sestrin1蛋白表达后,小鼠体内小鼠体内炎性因子表达水平明显升高。通过这些体内实验我们证明了 sestrin1蛋白能抑制与粥样硬化相关的炎性反应,在缺少sestrin1情况下会加重局部炎症,促进了粥样硬化病变进展。综上所述,sestrin1蛋白在粥样硬化中表达水平上调。抑制了ox-LDL及CHC诱导的NLRP3炎性小体的活化,通过调控抑制IKKβ磷酸化与加强IκBα的活化从而抑制NF-κB炎性信号通路激活,抑制相关炎性因子的分泌,最终起到改善粥样硬化病变局部炎性反应的作用。此外sestrin1蛋白能减少内膜下脂质沉积,减少泡沫细胞形成,这对于缓解局部炎性反应起到了一定作用。体内试验更加明确揭示了 sestrin1蛋白能改善粥样硬化小鼠主动脉局部的炎性反应和组织损伤。