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目的目前癌症依旧是引起死亡的主要原因,探究如何有效地抑制消融肿瘤的方法至关重要。本课题设计合成多功能树枝状大孔硅纳米粒子(DLMSN)为载体,原位沉积硫化铜(CuS)粒子,同时负载具有携氧能力的血红蛋白(Hb),然后包覆红细胞膜(RBCm),增加纳米粒子的稳定性和生物相容性,避免其被机体免疫系统识别,从而构建DLMSN/CuS/Hb/RBCm多功能纳米体系。由于CuS纳米粒子在近红外区具有较强的吸收,并能将其转化为热能,因而可用于肿瘤的光热治疗(PTT)。CuS纳米粒子还含有高原子序数(Z)的铜元素,能够增强对放射线的吸收而直接或间接损伤细胞DNA及其他成分从而增强放疗(RT)效果,因此利用DLMSN/CuS/Hb/RBCm多功能纳米体系有望联合光热治疗/放疗(PTT-RT)从而达到消除肿瘤的目的。内容本课题主要分为两部分:第一部分是DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子的制备和表征。主要包括优化DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子的制备条件,以及表征各步所得纳米粒子的形貌、水力直径(D_h)、表面电位、光学性质、元素组成及其溶液稳定性等。然后考察纳米粒子在水溶液中的光热性能和放疗增敏性能;第二部分是考察DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子在细胞水平的各种性能,包括其被肿瘤细胞摄取和对肿瘤细胞杀伤的性能,从而评价多功能纳米体系DLMSN/CuS/Hb/RBCm的细胞毒性以及联合PTT/RT对肿瘤细胞的杀伤效果。方法1、DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子的制备、表征及其在水溶液中的光热性能和放疗增敏性能:采用双模板法制备空白载体DLMSN,在DLMSN表面及其树枝状介孔中原位沉积CuS纳米粒子,然后负载Hb,并用RBCm对其表面进行包覆,成功构建多功能纳米体系DLMSN/CuS/Hb/RBCm。然后采用透射电子显微镜(TEM)观察制备过程中的各步所得纳米粒子的形貌,采用紫外-可见-近红外分光光度计(UV-vis-NIR)检测各步所得纳米粒子的光学性质,采用动态激光散射法(DLS)考察纳米粒子的D_h、多分散系数(PDI)和表面电位,以及采用能量色散X射线光谱仪(EDX)分析纳米粒子的元素组成;采用UV-vis-NIR和DLS考察DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子在超纯水(DDW)和含有10%胎牛血清(FBS)培养基中的光学性能、D_h、PDI变化,从而评价纳米粒子的稳定性;考察在近红外(NIR)激光照射下,DLMSN/CuS/Hb/RBCm在水溶液中的升温曲线,用红外热成像仪记录升温过程,用软件IRBIS3prof对结果进行统计分析,从而评价不同激光强度下、不同浓度DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子的光热性能;考察多次NIR激光照射对DLMSN/CuS/Hb/RBCm光热性能的影响,评价其光热稳定性。最后在生物学X-ray辐照仪(电压:160.0 k V,电流:25.0 m A)照射下,通过活性氧(ROS)的紫外探针9,10-蒽基-双(亚甲基)-二丙二酸(ABDA),评价DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子产生ROS的水平。2、DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子在细胞水平上的性能:以鼠源肿瘤细胞4T1细胞和人源脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞为细胞模型,考察DLMSN/CuS/Hb/RBCm对正常细胞和肿瘤细胞的细胞毒性;采用流式细胞仪检测荧光标记的DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子的入胞性能;采用MTT实验检测DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子在不同治疗方式(包括单独PTT、单独RT以及PTT-RT联合治疗)下对4T1细胞的杀伤能力,评价多功能纳米体系DLMSN/CuS/Hb/RBCm在PTT-RT联合治疗方法下对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果1、通过各种条件优化,成功制备了多功能纳米体系DLMSN/CuS/Hb/RBCm。TEM的结果显示,各步所得纳米粒子的粒径分别为DLMSN(102±8 nm)、DLMSN/CuS(104±12 nm)、DLMSN/CuS/Hb(106±10 nm)、DLMSN/CuS/Hb/RBCm(109±10 nm);UV-vis-NIR图谱结果表明,Hb的特征吸收峰在412 nm左右,而CuS纳米粒子在800-1000 nm范围内有较强吸收,最终所得DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子在412 nm和800-1000 nm范围内均有相应的特征峰;DLS检测各步所得纳米粒子的D_h和表面电位分别为DLMSN(156±7 nm,-28.2±3.1 m V)、DLMSN/CuS(168±16 nm,-25.6±3.3m V)、DLMSN/CuS/Hb(174±5 nm,-15.6±0.7 m V)、DLMSN/CuS/Hb/RBCm(175±1 nm,-23.9±0.3 m V);EDX能谱检测结果表明DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子中包含O、Si、S等元素。DLMSN/CuS/Hb/RBCm浓度为200μg/m L在不同激光功率下(0.5、1.0、1.5 W/cm~2)照射10 min,升温效果分别达到45、65和80℃;不同浓度DLMSN/CuS/Hb/RBCm在NIR激光照射下(1.0 W/cm~2,10 min),其温度随着浓度增大而升高,表明其光热性能具有浓度依赖性。凡是含有CuS的纳米粒子,在浓度为200μg/m L时,在NIR激光(1.0 W/cm~2,10min)照射后温度均能上升至65℃左右,证明其光热性能来源于CuS纳米粒子的光热转化作用;DLMSN/CuS/Hb/RBCm浓度为200μg/m L,在经NIR激光(1.0W/cm~2,10 min)多次照射后,其升温能力没有改变,表明其具有较好的光热稳定性;不同浓度DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子经过不同剂量的X射线(X-ray)辐照后,产生的ROS水平随浓度升高和放射剂量的增加而升高,表明DLMSN/CuS/Hb/RBCm的RT作用具有浓度和辐射剂量依赖性。2、将DLMSN/CuS/Hb/RBCm(0-80μg/m L)分别与4T1细胞和HUVEC细胞中共孵育24 h后,细胞活力均在80%以上,说明其对细胞没有显示明显毒性,具有较好的生物安全性。以FITC标记纳米粒子的细胞摄取实验结果表明,DLMSN/CuS/Hb/RBCm能够被肿瘤细胞摄取,并随孵育时间延长而增加。相比单一的PTT或RT治疗,多功能纳米体系DLMSN/CuS/Hb/RBCm(30μg/m L)在PTT-RT(NIR激光:1.0 W/cm~2,5 min;X-ray辐照:4 Gy)联合治疗方法下,对4T1细胞具有最强的杀伤能力,可使细胞活力降至约15%。结论本课题成功制备了以DLMSN为载体、原位沉积CuS纳米粒子、负载Hb并表面包覆RBCm的多功能DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子,其具有较好的溶液稳定性和生物相容性。体外实验结果表明DLMSN/CuS/Hb/RBCm纳米粒子能够被肿瘤细胞摄取,具有较好的生物安全性。同时显示了较强的光热性能和放疗增敏性能。通过联合NIR激光和X-ray照射,利用CuS纳米粒子的光热、放疗增敏性能以升温和产生ROS直接或间接损伤细胞DNA,从而诱导细胞凋亡或坏死,实现了多功能纳米体系DLMSN/CuS/Hb/RBCm联合PTT-RT治疗达到有效地抑制肿瘤细胞生长的目的。