【摘 要】
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肌肉增重是养猪生产实践中最重要的生长性能。目前主要是通过营养调控技术,辅以注射生长激素、生长激素释放激素,饲喂生长抑素耗竭剂或注射生长抑素基因工程疫苗等促进生猪的肌肉生长。然而,由于其一过性效应、动物毒副作用以及生物安全等原因,目前均尚未在实际生产中广泛应用。肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是重要的肌肉生长负调控基因,抑制动物出生前骨骼肌卫星细胞的激活以及出生后肌纤维的肥大。研究发现
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肌肉增重是养猪生产实践中最重要的生长性能。目前主要是通过营养调控技术,辅以注射生长激素、生长激素释放激素,饲喂生长抑素耗竭剂或注射生长抑素基因工程疫苗等促进生猪的肌肉生长。然而,由于其一过性效应、动物毒副作用以及生物安全等原因,目前均尚未在实际生产中广泛应用。肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是重要的肌肉生长负调控基因,抑制动物出生前骨骼肌卫星细胞的激活以及出生后肌纤维的肥大。研究发现,激活素受体ⅡB（Activin receptor ⅡB,ACVR2B）是与MSTN亲和力最高的受体。由此,ACVR2B可以作为MSTN中和抗体设计的重要候选蛋白,通过分泌型毕赤酵母系统表达猪源ACVR2B-Fc融合蛋白,提高蛋白得率,减少动物的免疫反应。1猪源ACVR2B-Fc融合蛋白质粒的构建与表达生物信息学分析发现:猪ACVR2B蛋白（NP001005350.1）共有512个氨基酸编码,其中1-22氨基酸是信号肽,39-117氨基酸是激活素Ⅰ和Ⅱ受体结合区域,194-484氨基酸是丝氨酸/苏氨酸激酶催化区域,491-512氨基酸是动力蛋白轻链1互作区域。此外,猪IgG前体蛋白（NP998993.1）共有474个氨基酸编码,其中1-19是信号肽,23-145氨基酸是IgG可变区,151-244氨基酸是IgG恒定区,265-474氨基酸是IgG Fc区域。分别针对猪ACVR2B胞外受体结合区以及IgG Fc区设计引物,将克隆出的基因片段插入T载体质粒。分别以测序正确的T载体质粒为模板,通过重叠PCR获得5,-SnaB I-ACVR2B-Fc-Not I-3’融合基因,最终将双酶切后的DNA片段插入表达载体pPIC9K。然后,将线性化的表达质粒电转入毕赤酵母菌株GS115中,经抗生素G418筛选和测序鉴定,选取阳性重组酵母菌株进行甲醇诱导表达。酵母培养液SDS-PAGE电泳后,进行考马斯亮蓝染色,结果表明:菌株（#52）诱导表达72 h后,上清中目的蛋白含量最高。将上清中的蛋白溶液通过ProteinA亲和层析柱纯化后,可获得纯化的融合蛋白ACVR2B-Fc。2猪源ACVR2B-Fc融合蛋白的体外功能验证考虑到融合蛋白ACVR2B-Fc正常发挥功能需同时满足两个条件:①能结合MSTN蛋白,②能被巨噬细胞识别吞噬。首先,将罗丹明B标记的ACVR2B-Fc融合蛋白与猪巨噬细胞系3D4/21共同培养2 h后固定和固定后直接进行免疫荧光显微镜观察。结果表明:ACVR2B-Fc融合蛋白与3D4/21细胞共培养2h后,可见细胞膜和胞浆中均有红色荧光信号,而不进行共培养只有细胞膜表面可以观测到红色荧光信号,说明ACVR2B-Fc融合蛋白的Fc区域能被巨噬细胞表面受体所识别,并被胞吞入细胞内。此外,不同含量罗丹明B标记的ACVR2B-Fc融合蛋白（0 pmol、32 pmol、48 pmol、96pmol、128 pmol、192pmol、382pmol、510pmol、1020pmol）被 3D4/21 细胞识别后,进行流式细胞分析。结果进一步表明:ACVR2B-Fc融合蛋白与3D4/21细胞结合率成S型,可能与3D4/21细胞表面存在多个Fc受体有关。3×106个3D4/21细胞大概需要1020 pmol的ACVR2B-Fc融合蛋白才能到达饱和。此外,将表达的MSTN前体和成熟蛋白分别与ACVR2B-Fc融合蛋白进行Dot-ELISA分析。结果表明:ACVR2B-Fc融合蛋白能够识别MSTN前体和成熟蛋白,并呈现线性比例。然后,将FITC标记的MSTN前体和成熟蛋白当作直接一抗,与结合ACVR2B-Fc的3D4/21细胞进行流式细胞分析。结果进一步表明:FITC标记的MSTN前体和成熟蛋白均能够与ACVR2B-Fc融合蛋白结合,并且其结合率成S型。综上所述,毕赤酵母表达的ACVR2B-Fc融合蛋白具有拮抗MSTN以及能够被巨噬细胞识别的生物学活性。
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