染色体异常是与遗传相关最常见的出生缺陷。由于染色体是基因的载体，因而染色体发生异常，将会导致基因增加或缺失，从而出现智力低下、多种器官、组织畸形，表现出多种症状和体征，它是造成出生缺陷的主要原因之一。影响严重的是迄今为止，尚无有效治疗方法。唯一有效措施是在孕期及早发现，及早处理，避免此类患者出生。　　 染色体异常分为数目异常和结构异常。胎儿常见的染色体异常发生在21，18，13号常染色体和性染色体X、Y的非整倍体异常，该类异常占活产儿染色体异常的95％，临床主要表现为21-三体综合征(DownSyndrome，DS)，18-三体综合征（EdwardSyndrome），13-三体综合征（PatauSyndrome），45，X(TurnerSyndrome)，47，XXY(KlinefelterSyndrome)等。在所有染色体异常中，DS是最常见染色体异常，没有产前诊断和治疗性流产干预的情况下，其出生率约为1.5‰。众所周知，DS是一种中度～重度智力低下，机体功能缺陷，器官多发畸形等的综合症候群，先天性心脏病患儿中有15～50％是DS。至今尚无有效的治疗方法，DS的医疗看护、康复、特殊教育与培训是个漫长的过程，需要有大量的投入，而且绝大多数病人丧失工作能力，只能被动地依靠社会、家庭的抚养。它给家庭和社会带来巨大痛苦和负担。　　 由于染色体异常无法治疗，因而孕期通过产前诊断，阻止异常的胎儿出生是降低染色体异常出生缺陷率的有效措施。产前诊断如果发生错误会导致患儿出生或正常胎儿流产，造成严重后果。所以应用于产前诊断的检测技术要求技术成熟、诊断准确率高，最大程度避免误诊和漏诊。20世纪70年代，首例羊水细胞培养、核型分析的成功，实现了在妊娠中期对染色体异常胎儿做出明确诊断，标志着产前诊断技术的建立。几十年来，传统的细胞遗传学技术曾是检测染色体异常的唯一方法。近十余年，随着各种分子生物学技术的飞速发展，很多新的染色体异常诊断技术开始发展和成熟。目前，用于产前诊断染色体异常的检测技术主要有3类技术，一是细胞遗传学技术即核型分析;二是快速染色体异常检测(rapidaneuploidydetection，RAD)技术，主要有荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization，FISH）和定量荧光多聚酶链反应技术(quantitativefluorescencepolymerasechainreaction，QF-PCR);三是分子核型技术即微阵列比较基因组杂交技术(array-basedcomparativegenomichybridization，array-CGHoraCGH)。由于任何一种检测技术都不可能完全诊断染色体异常，面对众多的检测技术，如何兼顾效益和检出率选择合适的检测技术用于产前诊断，关键是充分研究和了解各种染色体检测技术的局限性。　　 核型分析技术是非常成熟的技术，一直以来都是诊断染色体异常的金标准。它需要通过细胞培养后，再进行核型分析。产前诊断的绒毛、羊水细胞有两种培养方法:原位法和培养瓶两种方法。原位培养方法培养时间短，成功率高，对细胞培养中的嵌合问题容易判断。培养瓶法现在国际上已摒弃不用，绝大多数实验室都使用原位细胞培养方法。大多数使用平皿盖玻片的原位细胞培养方法，操作繁琐，对技术要求高，因此在国内尚未推广应用。很多国内实验室还是使用培养瓶法进行细胞培养。为解决此问题，需要找到一种操作简单、容易掌握、培养时间短的原位培养方法，来推广此培养技术在国内的应用，从而保证产前诊断的准确性。　　 尽管核型分析是诊断染色体异常的金标准，但由于细胞培养时间长，诊断周期长，一般需要2、3周，给孕妇及家属带来很大的精神压力。而且在细胞培养过程中，可能污染等原因导致培养失败，或受分裂相数量、质量、显带技术及操作人员技能的影响导致分析失败。且染色体核型分析分辨率低，对＜5M的片段的缺失和重复等无法检测。因此还需要发展其他的产前诊断技术来弥补核型分析报告时间过长和分辨率不高的不足。　　 以荧光原位杂交技术、定量荧光多聚酶链反应技术的分子细胞遗传技术为代表的快速染色体异常检测（rapidaneuploidydetection，RAD）。实现了在1～3天内诊断包括DS在内的常见染色体数目异常，显著缩短了报告时间。它对常见21，18，13号常染色体和性染色体X、Y的非整倍体异常检测的灵敏度和特异度已为许多大规模的研究证实。尽管RAD无法对所有染色体进行检测，但是在诊断常见的染色体异常方面如DS等，他们可与传统的核型分析技术相媲美，且方法简单、容易操作。并且它们的分辨率高于核型分析技术，可以检测3M左右已知位点的染色体微结构异常，是核型分析技术的有力补充。美国医学遗传学学院(AmericanCollegeofMedical)对RAD技术评价，为“相对成熟的技术、在某种程度上是和常规染色体分析作用相同的技术”。2004年，英国国家筛查委员会（UKNationalScreeningCommittee，UKNSC）宣布对于DS筛查高风险孕妇可以不采用核型分析的方法，直接通过FISH或QF-PCR确诊胎儿是否有DS。各国对于RAD技术的选择有所不同，欧洲广泛应用QF-PCR技术，而在美国、澳大利亚应用FISH技术较多。尽管RAD技术已经非常成熟，但在我国产前诊断临床应用领域并不普及，只有少数大的产前诊断中心逐步开始在临床应用。主要有3个问题未解决，一是RAD技术诊断的敏感性和特异性是否可以被接受;二是检测费用高，如何降低价格;三是，RDA是否可以作为一种诊断方法单独应用于胎儿染色体异常的产前诊断或如何应用于临床。我国对RAD技术的研究缺乏大样本临床资料，且相关这方面评价研究报道也非常少。因此需要针对这3个问题，评价RAD技术在国内产前诊断的临床应用效果，降低检测价格，评估FISH和QF-PCR这两种技术的区别，哪种技术更适合国内实验室发展，评估是否能够用RAD技术取代传统核型分析技术。　　 尽管RAD弥补了核型分析的一些不足，但RAD只能检测已知位点的染色体异常。而临床上相当一部分染色体不平衡畸变患者的染色体组或者基因组大多发生了未知的细微不平衡改变，核型检测技术和分子细胞遗传技术均无法检测。1998年研发出array-CGH技术，为解决这个问题提供了技术平台。它不仅分辨率高，且无需制备中期染色体，仅需1μg的DNA量，一次实验即可检测全基因组DNA拷贝数的变化，耗时仅72小时。能够可靠地检测出所有因染色体微缺失或微重复引起的基因组不平衡畸变，定位精确，清楚显示畸变片段内的基因含量，对发现、鉴定疾病相关基因有重要意义。　　 尽管该技术对染色体异常诊断价值很高，近年来逐步应用于产前诊断，成为热点技术，但国内将该技术应用于产前诊断临床的报道非常少。其原因是由于该方法不能检测没有发生基因拷贝数增减的染色体平衡畸变（平衡易位和平衡倒位）、多倍体和20％以下的嵌合体。由于分辨率过高，会检测出大量良性和不明临床意义的拷贝数变异（copynumbervariation，CNV），给孕妇及其家属带来不必要的焦虑，甚至担心胎儿的健康而终止妊娠。而且ArrayCGH的检测费用比常规染色体核型分析昂贵。对于这种非常有价值技术该如何应用才能发挥它的优越性，帮助诊断胎儿的染色体异常，是国内产前诊断领域需要解决的问题。　　 本课题目的是通过细胞核型分析、快速染色体异常检测以及array-CGH技术，三类4种染色体检测技术的临床应用研究，综合评价各种技术的应用范围，为国内医疗机构了解和开展产前诊断检测技术提供一个参考。　　 第一部分新型原位培养方法在产前诊断临床应用　　 目的:　　 建立一种操作简单、培养时间短、容易掌握的新型原位培养方法，便于在国内产前诊断推广应用。　　 方法:　　 1.实验分组:2009年1月～3月在我院产前诊断中心行羊膜腔穿刺术的118例孕妇，孕16周～23周之间，没有手术禁忌症者。抽取的羊水配对分为两组分别进行培养，实验组为新型原位培养瓶法，对照组为传统平皿盖玻片法。　　 2.标本接种:羊膜腔穿刺抽取21ml羊水，每组8ml配对分组，实验组接种到1个原位培养瓶，对照组接种到3个dish中的盖玻片上分别进行培养，其余5ml接种于T型培养瓶作为备份培养。　　 3.核型分析:按常规培养、收获、制片和显带，进行核型分析。　　 结果:　　 1.培养成功率:118例样本，实验组和对照组方法进行羊水培养，均培养成功。　　 2.培养时间:实验组培养时间和对照组相比较明显缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 3.细胞克隆和中期核型分裂相:培养后细胞克隆数，实验组只用一个培养瓶进行培养，获得的细胞克隆数仍多于对照组使用3个平皿进行培养获得的细胞克隆数，差异有统计学意义(P＜0.05)。收获后获得的满意染色体核型分裂相实验组多于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)　　 结论:　　 与传统平皿盖玻片比较，新型原位培养瓶的培养时间短、核分裂相多、传代率低，操作简单，适于在国内临床推广应用。　　 第二部分快速染色体检测(RAD)技术在产前诊断临床应用　　 目的:　　 研究FISH和QF-PCR两种技术在产前诊断的大样本临床应用结果，比较两种技术的优缺点，综合评估RAD技术临床应用的可行性。　　 方法:　　 1.随机选择1955例产前诊断样本:绒毛10例、羊水1036例用FISH进行检测;绒毛15例、羊水894例用QF-PCR进行检测，均以核型分析作为结果验证。　　 2.优化FISH技术以降低检测成本应用于绒毛、羊水样本的快速检测。　　 3.选取13、18、21、X、Y关键区域STR位点合成23对探针分两管扩增，建立QF-PCR多重PCR技术，同时检测常见5种染色体异常。　　 4.按照国际通用的对诊断技术评价的层次框架模式，从技术效能，诊断效能，效益评价，对RAD进行综合评估，获得该技术合适的国内产前诊断临床应用方案。　　 结果:　　 1.对1955例样本进行核型分析后，发现正常核型1892例，异常核型62例，其中数目异常40例，结构异常19例，嵌合体3例。　　 2.FISH检测1046例样本，成功率99.90％(1045/1046)，绝对敏感性96％(24/25)，绝对特异性100％(1021/1021)　　 3.改进杂交的处理过程，将探针杂交液的用量减为常规用量的1/4即2.5μL，探针杂交效率没有受到影响，探针杂交信号清晰。　　 4.QF-PCR检测909例样本，成功率99.89％(908/909)，绝对敏感性93.75％(15/16)，绝对特异性100％(892/892)　　 5.设计23对探针进行多重PCR扩增，扩增效率没有受到到影响，达99.78％。　　 6.在RAD的5种染色体检测范围内，共检出39例异常，与核型分析一致的符合率99.90％，漏诊2例。　　 7.在核型分析检出的所有染色体异常，RAD漏诊了23例，其中8例为有临床意义染色体异常，漏诊率0.4％(8/1955)。　　 结论:　　 1.优化FISH实验操作，提高杂交效率，可以达到减少探针杂交液用量，减少试剂成本，降低检测费用　　 2.选择的23个STR位点特异性高，多重扩增效率高，对5种染色体异常诊断效率高　　 3.FISH和QF-PCR两种RAD技术诊断5种染色体异常的灵敏度和特异度无显著性差异，由于FISH检测设备相对QF-PCR的设备价格低，而且有商业化的试剂盒对技术要求相对低，因此在一些病例数不多且没有开展分子诊断技术的中心，开展FISH检测有较高的可行性。　　 4.从检测范围(21，13，18，X，Y)的特异度和敏感度而言，RAD和核型分析在检测染色体异常方面没有显著差别。　　 5.RAD技术对于超声正常、单纯唐氏高危或是孕妇高龄的病例可以考虑用RAD检测部分代替核型分析的应用方案。　　 第三部分array-CGH技术在产前诊断中的临床应用　　 目的:　　 建立array-CGH技术平台，探讨array-CGH技术在产前诊断的应用价值和应用方案。　　 方法:　　 1.孕周在17～34周，34例产前诊断病例，1例羊水，33例脐血。羊水病例是由于胎死宫内，羊水培养不成功，无法行核型分析。4例脐血是羊水染色体检查发现可疑染色体不平衡易位。其余29例脐血是超声发现胎儿发育异常。　　 2.33例脐血按常规进行细胞培养、G显带染色体核型分析。有异常结果，同时检测父母染色体核型。　　 3.按OligoCGHMicroarray芯片的标准操作常规对34例病例进行检测。　　 结果:　　 1.本研究成功对34个样本进行了array-CGH技术分析，发现了7例异常。　　 2.病例1:G显带染色体核型结果为衍生X染色体，但无法确定条带[46，X，der(X)?t(X;?Y)(q12;q11)]。父母染色体核型正常。行array-CGH分析显示X染色体长臂发生了66Mb缺失，46，X，del(X)(q21.31-q28)　　 3.病例2:G显带染色体核型分析初步结果为9号染色体短臂插入部分片段，无法确定条带[46，XN，ins(9;？)(p12;?)]。母亲为相同9号染色体。行array-CGH分析实验结果提示胎儿微阵列结果未见异常。　　 4.病例3:G显带染色体核型分析考虑为10号染色体长臂插入了部分片段，本院脐血检查G显带染色体核型分析结果相同，但无法明确片段来源[46，XX，ins(10;？)(q22;?)]。父母染色体核型正常。array-CGH分析结果提示10号染色体长臂发生了22.5Mbp的重复，46，XN，dup(10)(q21.2-q23.1)。　　 5.病例4:G显带染色体核型分析，可疑18号染色体长臂部分缺失，但未确定断裂点，以及缺失片段是否有易位到其他染色体上[46，XN，del(8)(p11?)]。父亲染色体核型7号和18号染色体平衡易位，无法确定胎儿是否与父亲的易位一致。array-CGH分析，清楚显示7号染色体长臂发生了11.2Mbp的重复，18号染色体短臂发生了14Mbp的缺失，不平衡易位，46,XY,dup(7)(q36.1-q36.3),del(18)(p11.32-p11.21)　　 6.病例5:因胎儿发育异常，要求行羊水检查，穿刺术前超声检查发现胎死宫内，担心羊水细胞培养的成功率低，同时行array-CGH检测。G显带核型45，X。arrayCGH结果提示胎儿为X单体;同时发现在9号染色体长臂有11Mbp的重复，45，X，dup(9)(q34.11-q34.3)　　 7.病例6-34均因胎儿发育异常行核型分析和arrayCGH。病例6:G显带核型46，XN，der(14)(q12?)。array-CGH结果提示14号染色体长臂同时发生了重复和缺失，重复片段有30.7Mb，缺失片段有2.3Mb;病例7G显带核型47，XN，+13，array-CGH结果提示13号染色体整体片段发生重复，重复片段有96Mb，为13三体;病例8G显带核型47，XN，+21，array-CGH结果提示21号染色体整体片段发生重复，重复片段有33Mb，为21三体。病例9-34，G显带核型和array-CGH未发现异常。　　 结论:　　 1.Array-CGH技术是一种全新的分子核型分析技术，其分辨率和准确性极高，有效地克服或弥补了现有的染色体诊断技术的局限性。　　 2.Array-CGH技术应用于产前诊断中不平衡染色体病和胎儿发育异常的检测，可快速、准确地在分子水平上明确诊断，为产前诊断医生进行遗传咨询析提供科学依据，有利于准确评估胎儿预后和指导妊娠结局。　　 3.对于Array-CGH技术检测得到的结果，需要进行相应的生物信息数据库的查阅，以准确判断该基因组DNA拷贝数变异(copynumbervariation，CNV)是致病性改变还是良性变异。　　 4.在产前诊断的临床应用中，对于原因不明发育异常的胎儿，首先运用G显带技术进行分析，必要时需要父母双方检查作为参考，然后行array-CGH检测以明确诊断。