一、立题依据和目的 白细胞介素26(Interleukin-26，IL-26)又称为AK155，是2000年由Knappe等用扣除杂交(subtractivehybridization)方法在saimiri疱疹病毒(Herpesvirussaimiri，HVS)转化的T淋巴细胞中首先发现的。转化后很多功能保留的同时，只有几个细胞特征发生了明显变化。最显著的不同是转化后对CD2的刺激呈高反应性；另外，接受刺激后，出现IFN-γ高水平表达，使转化的T细胞由Th2型向Th0型分化。AK155与IL-10有很高的序列同源性，属于IL-10分子家族(IL-10、IL-19、IL-20、IL-22和IL-24)的新成员，因此人类基因组组织(Humangenomeorgnization，HUGO)建议将其命名为白细胞介素26，简称IL-26，并得到了白介素命名委员会的确认[2]。除了在HVS转化的T淋巴细胞中高表达外，在其他的T细胞系和天然外周血细胞IL-26表达水平较低[1，3-5]。IL-26的受体与其他已知的IL-10家族成员(IL-10，IL-19,IL-20,IL-22,IL24)的受体一样，都属于Ⅱ型细胞因子受体家族(theClassⅡcytokinereceptorfamily，CRF2)[6]。IL-26受体复合体是由配体结合链IL-20R1和非配体结合链IL-10R2组成的异二聚体，IL-26与其受体复合体的高亲和力结合导致STAT1和STAT3的快速磷酸化，从而传递活化信号。尽管IL-26受体复合体是IL-26高度特异的，不能被其它Ⅱ型细胞因子激活，但是IL-26受体复合体的亚单位却是构成别的Ⅱ型细胞因子受体复合体的重要组成部分。IL-10R2(CRF2-4)也是IL-10、IL-22和IFN-λ(IL-28A，IL-28B和IL-29)受体复合体的一个受体亚单位，而IL-20R1(CRF2-8)，好象是IL-26、IL-19、IL-20和IL-24共用的。虽然IL-26很可能在正常和病理血液学以及免疫学中起着重要作用，其具体的生物学功能还有待进一步阐明。最新研究发现IL-20能刺激造血系统，特别是多能造血干祖细胞向特异的细胞亚群分化[11]，基于IL-20和IL-26有共用受体，预测IL-26很可能也参与了造血细胞的分化过程。本研究拟采用基因工程技术构建人IL-26基因的原核和真核表达载体，并初步探讨其在大肠杆菌和哺乳细胞中的表达，为进一步研究其生物学功能及探讨用于基因治疗的可能性奠定基础。 二、方法和结果 1.人IL-26成熟肽的基因克隆及其在大肠杆菌中的重组表达 取正常人新鲜外周血，提取单个核细胞，用本室制备的RNA提取试剂盒分离纯化细胞总RNA。以RNA为模板，随机六聚体核苷酸为引物，在M-MLV逆转录酶的作用下进行反应，合成cDNA的第一链。根据GenBank报道的人IL-26的编码序列，设计扩增成熟人IL-26基因的两对引物，分别在内侧上下游引物5′端加上限制性酶切位点EcoRI和BamHI。设计内侧上游引物时，在成熟人IL26编码序列的上游加上起始密码子ATG，同时在上游加上保护性碱基GC，内侧下游引物加上TA，降低G+C含量，防止二级结构的形成，提高重组蛋白质的表达含量。以RT反应产物cDNA为模板，用TaqDNA聚合酶进行巢式PCR扩增hIL26基因。用低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化PCR扩增产物后，与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，接种于含100ug/mL氨苄青霉素的LB平板。用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，采用ABI3100-AvantGeneticAnalyzer全自动DNA测序仪测序，结果显示，克隆的基因和预期的成熟人IL26基因完全一致，成功构建了人IL26的重组质粒pMD18-T/hIL26。 用EcoRI和BamHI双酶切消化重组质粒pMD18-T/hIL26，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化hIL26片断，插入原核表达载体pBV220的PL启动子的下游，构建重组hIL26表达载体。重组子同样用菌落PCR和限制性酶谱分析筛选出阳性克隆，从而获得重组阳性质粒pBV220-hIL26。含有pBV220-hIL26的大肠杆菌(工程菌株)接种于含100ug/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，30℃振荡培养至对数生长期，42℃诱导4小时，离心收集细菌，进行SDS-PAGE和Westernblotting分析。结果显示，重组蛋白的表观分子量约18KDa，和文献报道一致，凝胶图像分析表明重组蛋白约占菌体总蛋白的20％。Westernblotting分析，重组蛋白能和抗人IL26抗体特异性反应，说明重组蛋白为人IL26。 为研究重组人IL26的生物学活性，进行小规模的发酵。工程菌以1∶100接种于含有葡萄糖和甘油的LB培养基中，30℃振荡培养至OD值约0.4-0.5，迅速转移至42℃水浴摇床又到5小时。4℃离心收集细菌，洗涤，超声破碎。7,000rpm离心洗涤，分离包涵体。沉淀用含0.2％的TritonX-100洗涤3次，纯化包涵体。用8M尿素溶解包涵体，然后用凝胶过滤初步纯化目的蛋白，SDS-PAGE分析显示，获得蛋白纯度约90％。 2.人IL-26全长基因的克隆及其在COS7细胞中的瞬时表达 为了探讨IL-26用于基因治疗的可行性，我们用同样的方法从人新鲜外周血单个核细胞中成功克隆并构建了带有信号肽序列的重组pMD18-T/hIL26，序列测定表明所克隆的人全长IL-26基因与GenBank上报道的完全一致。用SalI和EcoRI双酶切消化重组质粒pMD18-T/hIL26，低熔点琼脂糖凝胶电泳分离纯化hIL26片断，插入经相应酶切处理的真核表达载体pIRES2-EGFP的CMV启动子的下游，构建哺乳细胞表达载体pIRES2-EGFP/hIL26。pIRES2-EGFP/hIL26经酶切鉴定与预期结果一致，将重组质粒用非脂质体试剂Fugene6转染至COS7细胞中，荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Westernblotting分析证实hIL26基因得到了有效表达。 三、结论 1.成功克隆了人成熟IL-26基因，序列分析显示，克隆的基因序列和文献报道一致。 2.构建了成熟人IL-26的原核表达载体，获得稳定表达的工程菌株，重组蛋白约占菌体总蛋白的20％。 3.初步摸索优化了重组人IL-26的表达条件，包含体提取步骤，初步纯化工艺。 4.成功克隆了人全长IL-26基因，序列分析和文献报道一致。 5.成功构建了人IL-26基因的真核表达载体并实现了其在COS7细胞中的瞬时表达。