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目的通过对牙周健康人群和食管癌患者的fimA基因进行同源性分析,发现食管癌患者中存在优势表达的菌株;利用基因工程和杂交瘤技术,制备Fim A蛋白单克隆抗体,为进一步研制P.gingivalis快速诊断试剂盒提供物质基础。方法(1)fimA基因在牙周健康人群和食管癌患者中差异的研究:收集74例食管癌患者和135例牙周健康者口腔牙龈标本,PCR扩增fimA基因并测序,将测序结果与fimA基因6个型别的标准菌株进行比对,计算fimA基因在两组人群中的检出率及不同基因型构成;利用Clustal X软件对fimA基因进行同源性分析,观察在两组人群中的分布。(2)食管癌患者优势菌株中fimA基因的克隆与表达:以食管癌患者优势菌株的fimA基因为模板,构建原核表达质粒p ET-28a/fimA,并转化至BL21大肠杆菌中,构建BL21/p ET-28a/fimA工程菌,经IPTG诱导表达获得重组蛋白,利用His Trap HP镍柱对其进行纯化。(3)Fim A蛋白单克隆抗体的制备及应用:以上述基因工程Fim A蛋白免疫小鼠,获得杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体并鉴定其特性,制备ELISA试剂与PCR法进行比较以确定其临床性能。结果1.fimA基因在牙周健康人群和食管癌患者中差异的研究:经PCR扩增,fimA基因在食管癌组和牙周健康组的阳性率分别为70.27%和41.48%,差异有统计学意义(P<0.01);fimA基因分型结果显示,两组人群均以fimAⅡ型占比最高,各型别之间构成无统计学意义(P=0.59);经同源性分析,食管癌患者fimA基因在多个区域有明显的聚集簇,将其定义为食管癌患者的优势菌株。2.食管癌患者优势菌株中fimA基因的克隆与表达:成功构建原核表达质粒(p ET-28a/fimA)和原核表达菌株(BL21/p ET-28a/fimA-P008)。原核表达菌株在含卡那霉素的培养基中,当A600达0.6时,用1 m M的IPTG诱导,培养12h时,目标蛋白的表达含量最高;经检测,重组蛋白属于细菌包涵体蛋白,分子量大小与预测结果一致,经His Trip HP镍柱层析,PAGE电泳鉴定纯度>90%。3.Fim A蛋白单克隆抗体的制备及应用:成功制备了抗Fim A-P008蛋白的杂交瘤细胞株和单克隆抗体。经检测,小鼠腹水抗体效价为1:10~6;抗Fim A-P008单抗亚型为Ig G1型,此单抗特异性较好,与其他抗原无交叉反应;利用制备的单抗通过ELISA法检测P.gingivalis的Fim A抗原,与PCR法扩增标本的fimA基因相比较,两种方法结果差异无统计学意义(P=0.20)。结论本实验成功找到食管癌患者P.gingivalis的优势菌株,对其fimA基因进行克隆、表达并纯化Fim A蛋白,以此为免疫原,制备抗Fim A-P008单抗,初步鉴定效果良好,为研制P.gingivalis快速诊断试剂盒提供了物质基础。