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抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)作为雌性动物体内目前已知的唯一抑制始基卵泡生长的细胞因子,能够抑制芳香化酶活性、减少原始卵泡初始募集、降低卵泡FSH敏感性进而抑制卵巢功能。但禽类AMH的研究较少。本研究主要通过对鸡原代卵巢颗粒细胞中AMH基因进行靶向敲除和过表达,改变颗粒细胞中AMH及相关基因的表达水平,进而分析鸡卵巢颗粒细胞AMH在卵泡发育中的功能。结果如下:1.构建靶向鸡AMH基因敲除表达载体pll3.7-U6-SgAMH-spCas9和与之对应的SSA-RPG双荧光筛选报告载体pB-CMV-DsRed-CAG-AMH.200bp repeat.Puro-T2A-GFP,共转染鸡DF-1细胞系,报告载体水平敲除阳性细胞约占转染细胞的5%。T7E1酶切结果表明经Puromycin筛选可以明显富集阳性细胞,TA克隆测序表明筛选富集后DF-1中靶位点突变效率高达50%。2.鸡卵巢颗粒细胞体外培养容易自发凋亡,丧失特征性表型,同时失去FSH处理效应。通过改进分离方法、选择基础培养基、优化血清浓度,添加适宜浓度的激素、生长因子、维生素以及预铺鼠尾胶原,对培养条件进行优化。最终建立了在预铺鼠尾胶原作为胞外基质,采用含10%FBS、1×非必需氨基酸、1×复合维生素溶液和1×Anti-anti的DMEM培养液的优化培养体系,培养鸡小黄卵泡GCs 4代后仍能够保持其细胞特性。3.为了研究AMH基因在鸡卵巢颗粒细胞中的功能,将构建的敲除表达载体和SSA-RPG筛选报告载体通过Lipofectamine?3000共转至鸡SYF卵巢颗粒细胞中,48h后报告载体水平转染效率约有30%,敲除效率约占转染细胞的5%;经0.5μg/ml的Puromycin筛选进行富集后提取细胞基因组,TA克隆测序结果显示突变效率约为2%。构建过表达载体pcDNA3.1-AMH与敲除载体分别转染鸡GCs,转染24 h后添加2.5units/ml FSH处理细胞48 h,分析相关基因表达变化后发现:在鸡卵巢颗粒细胞中,AMH能够明显抑制目标基因Cyp19a1的表达,而此过程中Smad5和ALK2转录水平并没有明显改变。综上,通过相应载体敲除和过表达AMH基因能够明显改变鸡SYF的卵巢颗粒细胞中目标基因Cyp19a1的表达,而Smad5和ALK2转录水平却并没有发生明显变化。本研究结果有助于揭示AMH基因在鸡卵巢颗粒细胞中的作用机制,有望进一步了解家禽卵泡发育和卵泡选择的分子机理,其结果可为蛋禽育种提供实验依据与理论支撑。