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在实验室的前期研究基础上,以花生(Arachis hypogaea L.)汕油523种子为材料,用Sepharose4B柱纯化得到花生2s清蛋白,对花生种子中纯化的2s清蛋白进行组成和二硫键分析,Native-PAGE转SDS-PAGE显示天然状态下的花生2s清蛋白各组分是由不同的亚基组成,分子量在7~22 kD之间。通过非还原SDS-PAGE检测还原剂DTT和β-巯基乙醇处理前后的2s清蛋白发现,亚基内部含有丰富的二硫键,2s-3、2s-4、2s-5不存在链间二硫键,2s-1可能是以二聚体形式存在,通过链间二硫键相连。
通过透析复性和柱上复性的方法对原核表达的2s-3c融合蛋白进行复性,透析复性在pH7.9,0.5 mML-精氨酸,氧化型谷胱甘肽(GSSG)∶还原型谷胱甘肽(GSH)为1∶2,尿素梯度为4M—2M—0M的条件下进行。柱上复性是将纯化和复性同时进行,在纯化的过程中以pH7.9,含1mML-精氨酸,氧化型谷胱甘肽(GSSG)∶还原型谷胱甘肽(GSH)为1∶2,尿素梯度为4 M—2 M—0 M的复性液进行柱上复性。非还原SDS-PAGE结果显示两种复性方法复性的蛋白均发生了二硫键错配,形成了蛋白多聚体,但柱上复性的蛋白形成的蛋白多聚体比例略低于透析复性的蛋白。
将花生种子中纯化的2s清蛋白和复性后原核表达的2s蛋白作用于A549细胞发现,光学显微镜观察和MTT检测发现,低浓度和短时间天然状态下的2s清蛋白处理对A549细胞的增殖有一定的促进作用,随着处理浓度的升高和时间的延长,A549细胞的增殖受到明显的抑制,并呈现浓度依赖效应。但复性后的原核表达2s蛋白对A549细胞的增殖没有抑制作用。
为了进一步研究花生2s清蛋白促进A549细胞凋亡的机制,用半定量RT-PCR检测了caspase上游部分基因的表达情况。结果显示2s清蛋白处理后,iNOS和p53基因表达量都出现先上升后下降的趋势,而bcl-2基因在低浓度和短时间处理的时候呈现了表达量上升的趋势,随着处理时间延长表达又被抑制,该变化可能受到iNOS和p53的调控。促凋亡基因bax的表达量随着处理浓度和时间的增加而增加。但caspase-3的表达量无明显变化。提示花生2s清蛋白可能通过调节Bcl-2家族蛋白来促进A549细胞凋亡。