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目的1.评价补肾益肺消癥方治疗肺间质纤维化的临床疗效。2.探讨补肾益肺消癥方干预肺纤维化大鼠ERS和JNK细胞凋亡信号通路的作用机制。3.探讨补肾益肺消癥方调控人A549细胞ERS和抑制其凋亡的分子机制方法1.本研究开展了补肾益肺消癥方加减治疗肺间质纤维化的临床疗效观察。根据西医诊断标准和中医证候诊断标准筛选病例,共收集病例13例,3个月为一疗程。观察13例患者治疗前后疾病综合疗效、中医证候、mMRC呼吸困难分级、咳嗽症状积分、HRCT评分、6分钟步行试验及圣乔治呼吸问卷评分的变化情况,从而评价补肾益肺消癥方治疗肺间质纤维化的临床疗效。2.将SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组、中药预防组、中药治疗组、中药防治组,除空白组外,其他组均以博莱霉素致大鼠肺纤维化模型。中药预防组及中药防治组造模1d后开始给予补肾益肺消癥方12.68g/(kg·d)灌胃,空白组和模型组予等量生理盐水灌胃。造模28d后确定造模是否成功,并处死中药预防组大鼠,观察预防性给药对肺间质纤维化的影响;造模成功后,阳性药物组给予吡非尼酮53.57mg/(kg·d)灌胃,中药治疗组及中药防治组给予补肾益肺消癥方12.68g/(kg·d)灌胃,空白组和模型组仍给予等量生理盐水灌胃,持续28d。HE染色观察各组大鼠肺组织病理变化,real-time PCR及Western-blot检测肺组织中JNK信号通路相关因子GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表达及蛋白含量的差异。3.A549细胞贴壁生长24小时后,1640基础培养基同步化24小时,分为正常组、模型组、对照组、中药低浓度组、中药高浓度组,正常组继续予基础培养基培养,模型组予基础培养基+1%TGF-β1(5ng/ml),对照组予基础培养基+0.1%TGF-β1(5ng/ml)+0.02%TGF-β1抑制剂(2umol/L),中药低浓度组予基础培养基+1%TGF-β1(5ng/ml)+1%中药冻干粉(100ug/ml),中药高浓度组予基础培养基+1%TGF-β1(5ng/ml)+1%中药冻干粉(200ug/ml),继续孵育24小时,Western-blot检测A549细胞ATF6-α、GRP78、p-JNK、PERK、TRAF2、Caspase-12、CHOP、CAMKⅡ蛋白含量。结果1.补肾益肺消癥方治疗3个月后,疾病综合疗效方面,进步1例,稳定11例,无效1例,总有效率92.3%;中医证候方面,临床治愈0例,显效3例,有效8例,无效2例,总有效率84.6%;mMRC呼吸困难分级方面,其中显效4例,有效7例,无效2例,有效率为84.6%;较治疗前,患者日间、夜间咳嗽症状均有明显改善(P<0.01);较治疗前,胸部HRCT无差异(P>0.05);圣乔治呼吸问卷方面,较治疗前,患者呼吸症状、活动受限均改善(P<0.01,P<0.05),补肾益肺消癥方治疗3个月后,肺间质纤维化患者呼吸症状、活动受限方面均有减轻(P<0.01,P<0.05),疾病影响方面无统计学差异(P>0.05);较治疗前,患者6分钟步行距离改善(P<0.05)。2.肺组织切片HE染色显示,空白组大鼠肺组织结构正常;模型组大鼠肺组织肺泡结构破坏,纤维化伴蜂窝肺形成、瘢痕性成纤维化病灶、斑片状分布、侵犯边缘性腺泡或小叶为主;阳性药物组、中药预防组及中药治疗组肺泡轻度破坏,成纤维细胞有一定程度增生;中药防治组肺泡结构完整,有少量成纤维细胞增生,较模型组纤维化程度明显改善。各组大鼠肺组织中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表达情况与空白组相比,模型组大鼠肺组织中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2基因表达均增高;与模型组相比,阳性药物组中IRE1α的基因表达降低(P<0.05),余无统计学差异;中药预防组较模型组大鼠基因表达无统计学差异;中药治疗组大鼠肺组织中GRP78、TRAF2的基因表达较模型组下降(P<0.05);与模型组相比,中药防治组中GRP78、IRE1α、TRAF2基因表达降低(P<0.05)。各组大鼠肺组织中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2蛋白含量比较模型组较空白组大鼠肺组织中GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2蛋白含量高(P<0.05);阳性药物组、中药预防组与模型组比较,IRE1α表达降低(P<0.05),余蛋白表达无统计学差异,但仍可看出下降趋势;中药治疗组中GRP78、IRE1α蛋白含量较模型组降低(P<0.05);中药防治组中GRP78、IRE1α、p-JNK蛋白含量较模型组显著下降(P<0.05或P<0.01)。3.模型组比正常组 A549 细胞中 ATF6-α、GRP78、p-JNK、PERK、TRAF2、CAMKⅡ、Caspasel2、CHOP的蛋白含量增高(P<0.05);对照组与模型组比较,ATF6-α表达显著降低(P<0.01),GRP78、p-JNK、caspase12、CHOP 表达降低(P<0.05);中药低度浓度组与模型组比较,ATF6α、caspase12蛋白表达显著下降(P<0.01),GRP78、CAMKⅡ、CHOP蛋白表达降低(P<0.05),余蛋白表达量无统计学差异,但可看出下降趋势;中药高浓度组与模型组比较,p-JNK蛋白表达显著降低(P<0.01),TRAF2、CAMKⅡ、caspase12、CHOP蛋白表达降低(P<0.05),余蛋白表达量无统计学差异,但仍可看出下降趋势。结论1.补肾益肺消癥方对肺间质纤维化有一定的临床疗效,可以改善患者咳嗽、呼吸困难的临床症状,维持病情稳定,延长患者6分钟步行距离,提高患者运动耐力,改善患者活动受限,提高患者生活质量。2.通过下调GRP78、IRE1α、p-JNK、TRAF2的水平,调控JNK信号通路,减轻内质网应激,减少细胞凋亡是补肾益肺消癥方延缓肺纤维化的可能作用机制之一。3.通过下调 ATF6-α、GRP78、p-JNK、TRAF2、Caspase-12、CHOP、CAMKⅡ 的水平,调控JNK、CHOP、Caspase-12信号通路,减轻内质网应激,减少细胞凋亡是补肾益肺消癥方延缓肺纤维化的可能作用机制之一。