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人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cells,hESCs)是一种可以在体外稳定自我更新,并具有分化为成人机体任何一种细胞潜能的多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)。通过hESCs定向分化可以得到通常情况下难以获得,但对疾病治疗具有重要价值的细胞。因此,多能干细胞在再生医学中具有重要的应用价值。对神经系统而言,许多神经退行性疾病通常涉及神经元的死亡和缺失,如中脑多巴胺神经元死亡与帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)密切相关,而阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD)患者存在前脑基底胆碱能神经元(Basal Forebrain Cholinergic Neurons,BFCNs)的缺失。细胞移植有望改善神经退行性疾病的病理状态,对其产生重要的治疗作用,而通过人多能干细胞(Human Pluripotent Stem Cells,hPSCs)的定向分化获得特定类型的神经元将为神经退行性疾病的细胞治疗提供重要支持。目前利用化学生物学手段,即用活性小分子化合物调控干细胞命运已经成为干细胞研究中的热点领域。小分子化合物通过靶向特定分子在调控细胞信号转导,细胞能量代谢和表观遗传学机制等方面具有显著的优势:如其功能具有可逆性、其作用强度可以通过自身浓度进行调节等。课题组前期研究发现用小分子化合物同时抑制GSK3(Glycogen Synthase Kinase 3)以及TGFβ(Transforming Growth Factorβ)和Notch信号通路,可高度特异的将人胚胎干细胞在一周时间内诱导分化为原始神经干细胞。但是,通过该方法获得的神经上皮通常具有后端化的表型,这可能与抑制GSK3导致Wnt信号通路的激活有关。本课题拟在前期研究的基础上,利用化学生物学手段诱导hESCs分化获得具有前脑表型的神经干细胞。本课题以人胚胎干细胞系H1和HUES9为研究对象,用无血清无饲养层的培养体系培养和传代。在光镜下hESCs边缘清晰,排列紧密,细胞核大而细胞质少;细胞免疫荧光染色OCT4(Octamer-binding Transcription Factor 4)阳性,表明hESCs处于未分化状态。通过联合使用TGFβ抑制剂SB431542和Notch抑制剂RO4929097高效率的将人胚胎干细胞诱导分化为PAX6(Paired Box Protein 6)和Nestin阳性的神经上皮。进一步,利用低浓度GSK3抑制剂CHIR99021和SB431542,可维持神经上皮的长期自我更新,该细胞表达前脑标志FOXG1(Forkhead Box Protein G1)、OTX2(Orthodenticle Homeobox 2),神经干细胞标志PAX6、早期神经细胞标志Nestin,和细胞增殖标志分子Ki67,表明该细胞是具有前脑表型的前脑神经干细胞(Forebrain Neural Stem Cells,fNSCs)。该细胞可以响应SHH(Sonic Hedgehog)诱导的腹侧化作用,得到MAP2(Microtubule-Associated Protein 2)、NKX2.1(NK2Homeobox 1)和GABA(Gamma-Aminobutyric Acid)阳性的腹侧前脑中间神经元。然而,值得注意的是,上述神经干细胞PAX6阳性,提示其在背腹轴上可能偏向背侧定位。随后研究中,我们尝试在神经诱导过程中加入腹侧诱导因子SHH是否可以获得具有腹侧表型的神经干细胞。通过使用腹侧诱导因子SHH及其激活剂SAG(Smoothened Agonist)、TGFβ抑制剂SB431542等诱导hESCs神经分化,得到腹侧标志NKX2.1和前脑标志FOXG1阳性的腹侧前脑神经干细胞(Ventral Forebrain Neural Stem Cells,vfNSCs)。该细胞可在GSK3抑制剂CHIR99021,TGFβ受体抑制剂SB431542和SHH存在的条件下自我更新,并表达前脑神经细胞标志FOXG1、OTX2,早期神经细胞标志Nestin和细胞增殖标志分子Ki67;此外,该细胞还表达腹侧标志NKX2.1,表明其具有腹侧前脑神经干细胞的表型。进一步通过联合使用Wnt抑制剂XAV-939、Notch抑制剂RO4929097和SHH,可将上述腹侧前脑神经干细胞快速诱导分化为神经元。分化后的神经元表达腹侧标志NKX2.1、ISL1(Insulin Gene Enhancer Protein 1),神经元特异骨架蛋白MAP2,大多数神经元为GABA能神经元,表达GAD65(Glutamic Acid Decarboxylase65),且GABA呈阳性;只有少部分细胞表达胆碱能神经元标志ChAT(Choline Acetyltransferase)。综上所述,本课题通过化学生物学手段成功的将人胚胎干细胞定向分化为前脑神经干细胞,并可进一步高效的将神经干细胞分化为前脑抑制性中间神经元。本课题建立的定向分化体系不仅可以作为体外研究前脑发育的细胞平台,同时有效的前脑抑制性中间神经元获取手段也有望为阿尔茨海默症、Huntington舞蹈症等神经退行性疾病的干细胞治疗提供稳定的细胞来源,为其走向应用提供理论和方法上的依据。