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日本沼虾作为中国重要的淡水经济虾类,具有重要经济价值。对沼虾健康养殖的需求促使关注其免疫防御和抗逆性机制。当生物暴露于病原微生物、重金属等各类胁迫环境时,体内的应激蛋白如金属金属硫蛋白(metallothionein,MT)和热休克蛋白(heat shock protein,HSP)等往往会上调表达,以帮助宿主对抗有害刺激,维持内环境稳态。甲壳动物的MTs和HSPs属于两个大的基因家族,在抗逆过程中发挥着重要作用,对其家族成员进行系统分析和功能比较将有助于深入了解沼虾的抗逆分子机制,为其健康养殖提供指导。该研究搜索日本沼虾转录组,得到了4条MT和7条小热休克蛋白(small HSP,sHSP)基因序列,进而对其进行了生物信息学和功能分析,结果如下:
1、通过PCR和RACE技术(Rapid-amplification ofcDNAends)获得了4条MT基因的全长cDNA序列,并将其分别命名为MnMT1、MnMT2、MnMT3和MnMT4。利用大肠杆菌表达系统成功对这4条MT的成熟肽进行了重组表达,并进行纯化。通过微量热等温滴定量热仪(ITC)测得rMnMT1与Cd2+,Cu2+和Zn2+的解离平衡常数(Kd)与化学计量(N)等热力参数,确定rMnMT1具有金属结合活性,能够与Cd2+,Cu2+和Zn2+结合,但结合常数各有差别。利用构建的MnMTs原核表达系统来探究日本沼虾金属硫蛋白对抗重金属胁迫的能力,发现重组表达rMnMT1,能够提高大肠杆菌对Cd2+,Cu2+和Zn2+的耐受。
2、从日本沼虾转录组里筛选出7条MnsHSPs基因,qPCR检测结果表明这些基因均能在沼虾受到Cd2+和Cu2+胁迫后而发生不同程度的上调表达。重组的rMnHSP28.6在体外能有效阻止热诱导的柠檬酸合酶(CS)凝集反应和还原剂二硫酥糖醇(DTT)引起的胰岛素凝集反应发生,并能抑制高温引起的肌肉蛋白变性和过氧化物歧化酶(SOD)失活,展示出很好的分子伴侣功能。
以上研究证实金属硫蛋白和小热休克蛋白2个蛋白家族以各自不同的方式参与沼虾的抗逆反应,尤其在机体抗重金属、抗氧化等过程中发挥重要作用。
1、通过PCR和RACE技术(Rapid-amplification ofcDNAends)获得了4条MT基因的全长cDNA序列,并将其分别命名为MnMT1、MnMT2、MnMT3和MnMT4。利用大肠杆菌表达系统成功对这4条MT的成熟肽进行了重组表达,并进行纯化。通过微量热等温滴定量热仪(ITC)测得rMnMT1与Cd2+,Cu2+和Zn2+的解离平衡常数(Kd)与化学计量(N)等热力参数,确定rMnMT1具有金属结合活性,能够与Cd2+,Cu2+和Zn2+结合,但结合常数各有差别。利用构建的MnMTs原核表达系统来探究日本沼虾金属硫蛋白对抗重金属胁迫的能力,发现重组表达rMnMT1,能够提高大肠杆菌对Cd2+,Cu2+和Zn2+的耐受。
2、从日本沼虾转录组里筛选出7条MnsHSPs基因,qPCR检测结果表明这些基因均能在沼虾受到Cd2+和Cu2+胁迫后而发生不同程度的上调表达。重组的rMnHSP28.6在体外能有效阻止热诱导的柠檬酸合酶(CS)凝集反应和还原剂二硫酥糖醇(DTT)引起的胰岛素凝集反应发生,并能抑制高温引起的肌肉蛋白变性和过氧化物歧化酶(SOD)失活,展示出很好的分子伴侣功能。
以上研究证实金属硫蛋白和小热休克蛋白2个蛋白家族以各自不同的方式参与沼虾的抗逆反应,尤其在机体抗重金属、抗氧化等过程中发挥重要作用。