论文部分内容阅读
目的研究二氢青蒿素（DHA）对T细胞淋巴瘤细胞（Jurkat和HuT 78细胞）c-Myc蛋白磷酸化降解的影响,探讨DHA对T细胞淋巴瘤的作用机制。方法取对数生长期的T细胞淋巴瘤细胞（Jurkat和HuT 78细胞）进行实验。DHA作用于Jurkat和HuT 78细胞后,利用CCK-8法检测细胞增殖,计算细胞增殖率;利用流式细胞仪检测Jurkat和HuT 78细胞凋亡;利用实时荧光定量PCR法检测c-Myc、AKT、GSK3βmRNA的表达,以GAPDH作为内参,应用2-??Ct法计算c-Myc、AKT、GSK3βmRNA的相对表达量;利用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测c-Myc、p-c-Myc、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表达,以GAPDH作为内参,应用Image J软件进行灰度值分析c-Myc、p-c-Myc、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β蛋白的相对表达量。通过检测上述指标,分析DHA对T细胞淋巴瘤细胞c-Myc蛋白磷酸化降解及对AKT/GSK3β信号通路的影响。结果DHA可以明显降低Jurkat和HuT 78细胞的细胞密度,影响细胞膜的完整性;DHA能够抑制Jurkat和HuT 78细胞的增殖活性,该抑制作用具有时间和浓度依赖性,与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。根据CCK-8实验结果,分析得出DHA对Jurkat细胞作用的IC50为16.63μM,HuT 78的IC50为33.35μM;DHA可以促进Jurkat和HuT 78细胞的凋亡,15μMDHA作用于Jurkat细胞48h后,凋亡率上升到32.44%,对照组凋亡率为1.53%,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;30μMDHA作用于HuT 78细胞48h后,凋亡率增加到22.81%,对照组的凋亡率为1.65%,与对照组相比差异亦有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR实验结果显示:DHA可以下调Bcl-2 mRNA的表达,与对照组相比Jurkat、HuT 78细胞的Bcl-2 mRNA表达分别下降57%、64%,差异均有统计学意义（P<0.05）;DHA可以上调Bax mRNA的表达,与对照组相比差异亦有统计学意义（P<0.05）;DHA可以下调c-Myc mRNA的表达,与对照组相比Jurkat细胞的c-Myc mRNA表达下降了43%,HuT 78细胞的c-Myc mRNA表达下降了46%,差异均有统计学意义（P<0.05）;而DHA对AKT、GSK3βmRNA的表达水平影响不大（P>0.05）。蛋白免疫印迹结果显示:DHA使Jurkat细胞Bcl-2、c-Myc、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达量分别下调42%,31%,20%,16%,差异有统计学意义（P<0.05）;使HuT 78细胞Bcl-2、c-Myc、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达量分别下调63%,30%,23%,15%,差异有统计学意义（P<0.05）;DHA增加Jurkat、HuT 78细胞的Bax蛋白表达量分别达41%、51%,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;DHA使Jurkat细胞p-c-Myc蛋白的表达量增加了34%,使HuT 78细胞p-c-Myc蛋白的表达量增加了25%,与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.01）。结论DHA抑制Jurkat和HuT 78 T细胞淋巴瘤细胞的增殖,促进其凋亡,作用机制可能通过以下途径实现:DHA下调c-Myc mRNA的表达,进而降低c-Myc蛋白的表达量;DHA能够加强c-Myc蛋白的磷酸化,促进其降解;DHA可以抑制AKT/GSK3β信号通路,下调p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达量。本实验为DHA治疗T细胞淋巴瘤提供了一定的实验依据,并探讨了其具体的作用机制。