青香蕉苹果α-法尼烯合成酶基因的遗传转化研究

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:l447863596
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α-法尼烯是果实中主要的香气成分之一,具有许多重要的生物学功能,与昆虫的诱导性有关。α-法尼烯是诱导虎皮病发生的重要因素,虎皮病是苹果、梨在低温贮藏中后期发生的最严重的生理病害之一。果皮中α-法尼烯的生物合成是通过类异戊二烯途径中的甲羟戊酸途径,α-法尼烯合成酶是调控α-法尼烯合成的关键酶,催化FPP转变为α-法尼烯。 为进一步研究α-法尼烯合成酶的功能,本实验构建了青香蕉苹果α-法尼烯合成酶基因正义、反义、RNAi表达载体;利用RT-PCR的方法扩增青香蕉苹果α-法尼烯合成酶基因的全长,构建亚细胞定位表达载体,对该酶进行亚细胞定位研究;建立并完善了青香蕉苹果的高效再生体系和遗传转化体系;农杆菌介导法转化青香蕉苹果和丰产梨,初步获得转基因植株。主要结果如下: 1.构建正义和反义表达载体,并将其转入农杆菌EHA105。 2.构建α-法尼烯合成酶基因RNAi表达载体,酶切和测序结果表明RNAi目的片段已经正确插入到构建的质粒表达载体中。 3.通过克隆青香蕉苹果的α-法尼烯合成酶基因(AFS)全长,构建PBI-AFS-GFP真核表达载体,农杆菌介导转化洋葱表皮细胞,瞬时表达AFS-GFP融合蛋白,首次发现该酶定位于细胞膜上。 4.以青香蕉苹果的叶片为材料,进行了不同激素配比及其它影响因子对叶片、根系再生和增殖影响的研究。结果表明:最适宜青香蕉叶片再生不定芽的培养基为MS+BA4.0mg/L+TDZ1.0mg/L+IAA0.8mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,再生频率高达100%,最适的暗培养时间为20天,叶片正放在培养基上的再生效果优于反放,生根培养基为1/2MS+IBA0.7mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.0g/L,最终建立了青香蕉苹果叶片高效再生体系。 5.完善了青香蕉苹果的遗传转化体系,确定在再生过程中Kan选择压为15mg/L;通过研究不同浓度的头孢霉素和羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果,确定抑菌过程中以头孢霉素100mg/L+羧苄青霉素100mg/L为宜。 6.初步验证已将正义和RNAi表达载体转入青香蕉苹果,将反义和RNAi表达载体转入与青香蕉苹果同源关系较近的丰产梨中。
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