论文部分内容阅读
银屑病是一类以界限清晰的红斑、银色鳞屑为主要表现的慢性免疫性皮肤病。因地理位置和种族差异不同,在世界范围内患病率差别较大,约为0.1-4%。总体而言,高加索人群患病率较亚洲人群高。我国银屑病患病率约为0.123%,患者总数将近1000万例,其分布趋势为城市高于农村,北方高于南方,男性高于女性。银屑病发病机制不清,普遍认为是遗传和环境因素共同作用的结果。既往研究显示其遗传度约为60-90%,然而当前基于DNA序列变异的研究仅能解释13%的疾病发生,提示表观学,环境因素,基因-基因相互作用等可能与疾病相关。以DNA甲基化和组蛋白修饰为主的表观遗传学是人类基因组学中重要的调控因素,甲基化能够解释部分DNA序列变异以外的疾病遗传度。DNA甲基化通过抑制转录因子与DNA序列的结合或者募集甲基化结合蛋白的方式控制基因的表达水平。甲基化结合蛋白与其他调控机制结合,如组蛋白乙酰化或去乙酰化,诱发染色体构象变化并控制基因的表达。DNA甲基化研究已在肿瘤等多种疾病和生物学通路中被广泛研究。现有银屑病的DNA甲基化研究在两个层面展开,即针对候选基因启动子和无偏倚的全基因水平。候选基因研究如p15和p21蛋白启动子基因在银屑病组织中甲基化过低；对比特应性皮炎患者和正常个体,发现SHP-1(PTPN6)基因启动子完全脱甲基化。全基因组甲基化分析病例对照研究发现一批与免疫、表皮分化复合体等疾病相关基因。然而既往研究存在样本量偏小,基因组覆盖度偏低,基因表达数据不完整等情况使得大量潜在位点或易感基因没有被发现。因此开展大范围的银屑病全基因组甲基化研究,整合高精度RNA表达数据将有助于发现疾病风险基因。目的：在全基因组范围内搜寻银屑病相关DNA甲基化位点,整合转录组表达数据,发现疾病风险易感基因。方法：采用IlluminaHuman450K芯片对114例患者皮损,41例非皮损,62例对照个体的皮肤组织DNA分析近450000个位点的CpG甲基化水平。位点甲基化差异分析采用Wilcox中位数秩和检验分析,并经Benjamini-Hochberg法矫正多重检验。Spearman相关性检验分析甲基化与基因表达相互关系。sequenom质谱系统验证差异性甲基化位点。结果：通过分析皮损/(非皮损+对照)DNA的甲基化高低,发现286个差异性甲基化位点,分布于188个基因。整合全基因组转录组数据,发现36个基因表达与甲基化相关,包括AIM2, TGFBR3, PHYHD1, PHOB, FOLR1, ZC3H12A, LYPD1和ZBP1等。1.比对41对病人皮损和非皮损发现1638个差异性位点,在皮损组织中过高和过低甲基化位点分别为954和684个。2.比对73例病人皮损和62个正常个体发现434个差异性甲基化位点。同时比较皮损/(非皮损+对照),发现286个差异甲基化位点,位点分布于188个基因上。3.分析286个位点在基因组中的分布情况,发现位点在特定CpG区域富集。近60%位点位于开放区域(Open Sea),42.4%位点位于基因体内(Gene body)4.DAVID基因功能注释显示,188个显著性基因中,显示甲基化过高的基因在蛋白磷酸化、RNA转录调节等方面富集。而低甲基化基因无明显富集(P<0.05)5.相比既往欧美报道的1108个差异性位点,通过IlluminaHuman450K可获得776个位点数据,其中456个达到显著性水平,较随机出现的可能性有显著差异(Chi-square=276.5,P< 2.2×10-16)。比较两项研究,456个位点中仅1个甲基化位点差异方向相反。6.通过转录组测序可分析188个基因当中178个基因的表达数据。发现19个(13.3%)DNA甲基化升高伴基因表达降低,16个(9.4%)甲基化降低伴基因表达升高。提示约有五分之一DNA甲基化差异与基因表达相关。呈现甲基化表达负相关的基因包括：AIM2, TGFBR3, PHYHD1, PHOB, FOLRl, ZC3H12A, LYPD1和ZBP1等。7.构建因果关系模型分析遗传标记(SNP),甲基化,疾病状态关系,发现3个CpG位点为潜在调节SNP作用于疾病的调控点。结论：通过非配对病例对照分析发现286个银屑病差异性甲基化位点,对应于188个基因。整合全基因组转录组表达数据,发现36个DNA甲基化/基因表达呈现负相关,包括AIM2, TGFBR3, PHYHD1, PHOB, FOLR1, ZC3H12A, LYPD1和ZBP1等,该批基因可能与银屑病发病机制相关；通过CIT因果分析发现C1orf106, DMBXl和SIK3基因可能在调节遗传变异位点对银屑病的过程中发挥作用。