论文部分内容阅读
肿瘤多药耐药严重影响化疗效果，甚至导致化疗失败，所以对于耐药机制及克服策略的研究尤为重要。本课题第一部分通过建立人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株及对应的体内耐药模型，初步探讨食管鳞癌紫杉醇耐药的耐药机制。第二部分利用第一部分建立的耐药模型，研究新型抗肿瘤化合物JP的抗耐药肿瘤作用及其机制。第一部分：人食管鳞癌体内外耐药模型的建立本部分采用高浓度间歇诱导结合时间递增的方法建立了人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞模型，采用皮下移植的方法建立了对应的体内裸鼠移植瘤耐药模型，并探讨了两者的生物学特性及耐药机制。方法：以紫杉醇(Paclitaxel，PTX)为诱导药物，人食管鳞癌EC109细胞为亲本细胞，应用高剂量间歇诱导结合时间递增的方法，历时6个月时间，建立了人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株EC109/Taxol。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测耐药细胞对紫杉醇、5-氟尿嘧啶、表阿霉素、顺铂的耐药性；连续七个月监测耐药细胞的耐药稳定性；倒置显微镜及荧光显微镜观察紫杉醇诱导前后细胞和细胞核形态学变化；Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡率；对比EC109与耐药细胞的生长曲线及倍增时间；平板克隆实验测定亲本细胞和耐药细胞的克隆形成能力；流式细胞术对比分析亲本细胞和耐药细胞的周期分布情况；Westernblot分析产生耐药前后细胞内Bcl-2、Bax、Procaspase-3、P-gp蛋白的表达变化情况；耐药细胞罗丹明123（Rh123）摄入/排出功能的检测；利用体外耐药模型，采用皮下移植法建立裸鼠移植瘤体内耐药模型，并对其耐药性进行鉴定。结果：耐药细胞株EC109/Taxol对紫杉醇的耐药指数（RI）为67.157，且耐药性稳定，同时对未接触过的5-氟尿嘧啶、顺铂、表阿霉素交叉耐药。EC109/Taxol细胞形态不规则，体积偏小，常趋于群集性生长，细胞核大而圆，结构完整，染色均匀。耐药细胞的自然凋亡率较亲本细胞低，100nM PTX诱导24h后，亲本细胞的凋亡率明显高于耐药细胞。耐药细胞的增殖速率及克隆形成率较EC109细胞低，倍增时间延长。G0/G1、S期比例增加，G2/M期减少。Westernblot结果显示，EC109/Taxol细胞中Bcl-2、Procaspase-3、P-gp蛋白表达较EC109细胞明显增加，而Bax的表达明显低于EC109细胞。Rhl23摄入/排出功能的检测表明EC109/Taxol细胞P-gp的表达量及功能较EC109细胞高。成功建立裸鼠移植瘤体内耐药模型，成瘤率为100%，且存在明显的耐药性。第二部分：新型抗肿瘤化合物JP的抗耐药肿瘤作用及机制研究本部分主要是研究新型抗肿瘤化合物JP的抗耐药肿瘤活性，并探讨其作用机制。方法：选用人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株（EC109/Taxol）与相应的敏感细胞株（EC109）为研究对象，采用MTT法、生长曲线法、集落形成法测定JP对细胞增殖的影响。流式细胞术检测JP对耐药细胞株周期分布的影响。Hoechst33258染色法、Annexin V/PI双染法检测JP对EC109/Taxol细胞凋亡的影响。Westernblot观察JP对EC109/Taxol细胞内p53、Procaspase-3、Cleaved-caspase-9、Procaspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果：MTT实验结果表明，JP对EC109、EC109/Taxol细胞的IC50数值接近，证明其在药敏和耐药细胞中均有杀伤作用，且这种作用呈明显量效和时效关系。同时，JP对EC109/Taxol细胞的生长曲线及克隆形成率均有抑制作用，且数值接近。另外，JP可剂量依赖地升高EC109/Taxol细胞G2/M期细胞的比例，使细胞周期阻滞于有丝分裂后期。Hoechst33258染色法、Annexin V/PI双染法结果均表明JP可剂量依赖的诱导EC109/Taxol细胞凋亡。JP对EC109/Taxol细胞内Bax蛋白表达无影响，但上调p53和Cleaved-caspase-9蛋白的表达，下调Procaspase-3、Procaspase-9和Bcl-2蛋白的表达。结论：1、成功建立了人食管鳞癌紫杉醇耐药细胞株EC109/Taxol及对应的体内耐药模型，为深入研究肿瘤耐药机制、寻找逆转肿瘤耐药措施以及筛选新的抗癌药物提供了可靠的体内外实验模型。2、 JP具有较强的抗耐药活性，且能明显解除紫杉醇耐药细胞株EC109/Taxol的凋亡抑制。对其的研究为治疗耐药肿瘤提供了新的途径。