研究目的:金黄色葡萄球菌,是一种食品中常见的病原微生物,其产生的肠毒素是导致食物中毒的主要原因。金黄色葡萄球菌肠毒素对胃肠道具有极大地损伤作用,可以引发呕吐、腹部绞痛、腹痛、休克等急性中毒症状,严重时可导致循环衰竭甚至死亡。目前,针对金黄色葡萄球菌的检测方法主要有以下三种,分别为分离培养鉴定法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法,但这些检测方法存在着操作步骤繁琐、检测时间长、灵敏度低以及对仪器设备和人员素质依赖性强等问题。因此,建立一种操作简便,灵敏度高且准确性好的金黄色葡萄球菌检测方法,对于预防和控制由金黄色葡萄球菌引发的食品安全问题有着极其重要对意义。本课题旨在通过将噬菌体展示技术、免疫磁性分离技术和聚合酶螺旋反应技术相结合,建立一种金黄色葡萄球菌的可视化快速检测体系,并对所建立的检测方法在人工模拟样品中的应用进行评价,为食品安全的监督和防控提供一定的技术支撑。研究方法:1.金黄色葡萄球菌噬菌体多肽的筛选与鉴定以金黄色葡萄球菌灭活菌液为靶标,使用Ph.D.-12肽库试剂盒,通过四轮生物淘选程序后,获得可以在空间构象上与靶标金黄色葡萄球菌特异性结合的多肽。随机挑选多个噬菌体单克隆,利用ELISA方法鉴定噬菌体单克隆与金黄色葡萄球菌的结合能力。同时通过ELISA方法鉴定单克隆与大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生性李斯特菌和鲍氏志贺菌的结合能力。对阳性噬菌体单克隆进行DNA提取及测序翻译,将与金黄色葡萄球菌特异性结合能力强的多肽送至工程公司修饰以生物素并合成。2.磁性纳米生物探针的制备及富集效率的测定功能化的磁性纳米粒子表面修饰以链霉亲和素,淘选所得金黄色葡萄球菌噬菌体多肽用生物素进行修饰,通过“链霉亲和素—生物素”相互结合的特点,将两者共同混悬孵育,制备得到磁性纳米生物探针。利用所制备的磁性纳米生物探针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和鲍氏志贺菌进行富集,对探针的特异性进行鉴定。最后对磁性纳米生物探针的多肽浓度、磁性纳米生物探针总用量、孵育时间进行优化,使其对目标菌的富集达到最佳效果。3.聚合酶螺旋反应体系的建立与评价根据数据库和相关文献,参考选出金黄色葡萄球菌的保守序列,并将选取的保守序列基因,在NCBI上进行Blast序列对比,确定基因为靶序列后使用Primer explorer V5进行聚合酶螺旋反应的引物的设计。对设计好的多套引物进行合成验证,从中筛选出扩增效率最好的一套作为最佳引物,用于后续操作。设计完成的引物对其特异性进行验证,同时对反应过程中的温度条件进行优化,确定反应的灵敏度,建立最优的反应体系,并与常用的检测方法进行比较。4.基于噬菌体展示技术、免疫磁分离技术和聚合酶螺旋反应的技术的模拟样本的检测与评价将金黄色葡萄球菌进行10倍梯度稀释（8.4×10~5～8.4×10~1CFU/m L）,加入到无菌的模拟样品牛奶中。将合成的磁性纳米生物探针加入到含有金黄色葡萄菌的模拟样品中,磁分离与富集后,提取DNA,利用优化后的PSR反应体系进行扩增并对扩增产物进行检测,测定该体系的检测灵敏度,并选择常见的非目标食源性致病菌对其特异性进行验证。研究结果:1.金黄色葡萄球菌噬菌体多肽的筛选与鉴定以金黄色葡萄球菌为靶标,通过四轮差减筛选,回收效率逐渐提高,第四轮产出/投入可以达到2.2×10-5。随机挑选14个噬菌体单克隆,经过扩增与噬菌体DNA的提取测序翻译,得出7个出现频率较高的阳性噬菌体单克隆。使用ELISA方法测定其结合能力及特异性。最后选择出现频率较高,分别为5次,6次的两个噬菌体单克隆P1“WHWRLPV”和P2“MNVTFTT”用于后续实验,其P/N分别为2.60和2.64。其P/N均大于等于2.1。2.磁性纳米生物探针的制备及富集效率的测定使用两种多肽P1和P2合成的磁性纳米生物探针的富集效率分别为92.7%和97.2%,因此,选择P2“MNVTFTT”为最佳多肽。同时,磁性纳米生物探针对大肠杆菌O157:H7的非特异性吸附为20.8%,对鼠伤寒沙门氏菌的非特异性吸附为11.1%,对单增李斯特菌的非特异性吸附为16.1%,对鲍氏志贺菌的非特异性吸附为0.0%,表示其特异性良好。对磁性纳米生物探针的条件进行优化,当磁珠用量不变,多肽用量为0.05 mg、0.10 mg、0.15 mg、0.20 mg、0.25 mg,其富集效率分别为96.3%、97.0%、99.1%、98.5%、94.1%;当磁珠量和多肽用量固定不变时,孵育时间为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min,其富集效率分别为98.3%、99.3%、100.0%、99.3%、99.8%;当磁性纳米生物探针的总用量为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL时,其富集效率分别为94.4%、95.2%、93.6%、96.4%、86.2%。3.聚合酶螺旋反应体系的建立与优化以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因即nuc基因,及保守序列16S r RNA作为靶基因,进行引物的筛选与鉴定,最终选取金黄色葡萄球菌的nuc基因为保守序列,并选择相应扩增效率较好的引物nuc-1作为扩增引物。通过对PSR反应体系中的各个反应条件进行优化,最终确定其最佳反应温度为64℃,反应特异性良好。同时,该反应体系总体积为25μL,对金黄色葡萄球菌的最低检出浓度可以达到1×10~1CFU/m L,将从金黄色葡萄球菌提取DNA用dd H2O连续10倍梯度稀释后,最低检出浓度可以达到1.5 pg。4.基于噬菌体展示技术、免疫磁分离技术和聚合酶螺旋反应技术的模拟样本检测与评价对人工污染金黄色葡萄球菌的食品样品牛奶的检测结果显示,对金黄色葡萄球菌的最低检出浓度均为8.4×10~1CFU/m L。此外,阳性样品颜色变化与荧光曲线结果和与凝胶电泳结果相一致,阳性样品为蓝色,阴性样品为紫色。该检测方法准确度高,灵敏性好,且快速,准确,最快能够在150 min内得出检测结果,实现裸眼判定阳性和阴性结果,满足金黄色葡萄球菌的现场快速可视化检测的需求,有较好的实际应用价值。研究结论:1.本研究将噬菌体展示技术、免疫磁性分离技术和聚合酶螺旋反应技术多种技术融为一体,构建了一种针对金黄色葡萄球菌的快速、高效的可视化检测体系。2.该反应体系最快可以在150 min内完成金黄色葡萄球菌检测,对目标菌基因组DNA的检出限可以达到1.5 pg,对目标菌模拟食品样品中的检出限为8.4×10~1CFU/m L,该反应体系有较好的灵敏度和特异性,可以满足食品在现场快速检测中的需求。