荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET）作为一种高效的光学“分子尺”,在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。基于荧光蛋白的遗传编码FRET传感器具有高灵敏度和非侵入性的特征,对我们理解细胞内的信号组织和信号调控起了重要作用,实现了前所未有的时间和空间分辨率可视化信号检测。FRET要求供体发射光谱与受体吸收光谱有很大的重叠,但目前满足该条件的荧光蛋白FRET对的选择范围十分有限。嵌合物的不同组合方式能综合多种材料的性能,通过设计可达到组分之间性能优劣互补的目的,这样不仅丰富了嵌合物自身功能,甚至为某些科研瓶颈带来了全新的解决方案。鉴于荧光蛋白模拟物的快速发展以及G4封装后可实现部分荧光蛋白模拟物的荧光激活,发展蛋白核酸嵌合式的FRET对将有望进一步拓展FRET传感器的构建途径。然而,以模块化设计基于蛋白核酸嵌合物的FRET对关键在于蛋白与核酸的高效稳定连接。为了发展基于蛋白核酸嵌合物的FRET传感新方法,本文对HUH核酸内切酶（HUH endonucleases）超家族中鸭圆环病毒蛋白（duck circovirus,DCV）的功能进行了深入研究。鉴于其独特的限制性内切酶活性、连接酶活性以及蛋白质本质,DCV非常适合作为连接模块,通过融合表达实现目标蛋白与特定核酸序列的共价连接。我们将此“蛋白-DCV-核酸”模块化的蛋白核酸嵌合物设计为FRET对,其中FRET供体为具有大斯托克斯位移的橙色荧光蛋白（LSSm Orange）,受体为本课题组前期工作中合成的小分子染料（1a）与DNA的组装产物DNA（1a）。基于蛋白核酸嵌合物的FRET对极大地拓展了FRET供受体的选择范围,为FRET传感器提供了全新的设计思路。利用蛋白质工程技术在融合蛋白部分加入细胞膜定位功能元件和蛋白水解酶响应元件,基于此获得的传感器有望实现细胞膜特定蛋白酶的原位实时检测,进一步拓展了这类基于蛋白核酸嵌合物的FRET传感器的应用范围。具体研究内容如下:1、DCV和LSSm Orange的体外表达和性能研究。通过研究DCV与核酸反应的系列条件,证明了DCV与特定DNA之间可以发生快速、稳定且高效的共价连接反应,而且DNA的3’端延长不会影响其与DCV之间的共价连接。随后,我们进行了LSSm Orange的克隆和体外表达,并对LSSm Orange的荧光性质进行初步研究;2、基于蛋白核酸嵌合物的FRET对的构建和性能优化。构建p ET28a-lssmorange-dcv重组质粒并在体外表达LSSm Orange-DCV融合蛋白,证明DCV的N端融合其他蛋白不会对其酶活性产生影响。LSSm Orange-DCV与DNA共价连接后形成LSSm Orange-DCV-DNA,加入小分子染料可以检测到FRET信号。通过分析LSSm Orange的三维结构,确定截短LSSm Orange的C端以缩小供受体距离,将该FRET对的EFRET从18%提高至60%左右;3、基于蛋白核酸嵌合物的FRET传感新方法。首先,鉴于1a的缺电子结构可与亲核试剂发生反应,发展基于蛋白核酸嵌合物的FRET传感新方法,用于溶液体系中的HSO3-的高特异性高灵敏度检测。随后,在LSSm Orange’-DCV融合蛋白中通过蛋白质工程引入插膜元件和蛋白水解酶识别底物序列,实现了该传感器的细胞膜定位和对特定蛋白水解酶活性的响应,为基于蛋白核酸嵌合物的FRET传感平台的设计和应用奠定基础。