论文部分内容阅读
目的：在小鼠乳腺癌细胞系(4T1)和小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)模拟的肿瘤微环境中,探讨PTEN对于巨噬细胞表型转化的抑制作用及机制。方法：用小鼠乳腺癌细胞系4T1的培养上清和RAW264.7小鼠巨噬细胞共培养模拟肿瘤微环境,驯化RAW264.7细胞向M2型转化(TSN-exposed RAWs);采用RT-PCR和WB方法比较RAW264.7细胞在与4T1细胞上清共培养前后M1型和M2型(TSN-exposed RAWs)巨噬细胞中PTEN分子在mRNA和蛋白质表达水平的变化；通过转染PTEN shRNA质粒到TSN-exposed RAWs细胞中,沉默目标PTEN mRNA;采用Q-PCR及WB方法检测TSN-exposed RAWs细胞沉默PTEN前后PTEN, NHERF-1, VEGF-A, HIF-1a分子的表达；通过流式细胞术检测TSN-exposed RAWs细胞沉默PTEN前后,M2型所占的比例；应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测TSN-exposed RAWs细胞沉默PTEN前后培养液上清中CCL2的含量；同时用ELISA、Q-PCR和WB检测转染pEGFP-PTEN质粒后的TSN-exposed RAWs细胞中CCL2, PTEN, VEGF-A, HIF-1a和NHERF-1的表达；用transwell检测TSN-exposed RAWs细胞转染不同质粒上调或者下调PTEN的表达对4T1小鼠乳腺癌细胞迁移的影响。结果：4T1上清驯化RAW264.7细胞,在完成驯化的TSN-exposed RAWs细胞中,PTEN的表达明显下调,并且我们还在人的乳腺癌和胃癌组织中的巨噬细胞中检测PTEN的表达,结果表明PTEN在M1和M2型巨噬细胞中均有表达。TSN-exposed RAWs细胞沉默PTEN后与M1型细胞相比,CCL2和VEGF-A的表达明显上调,NHERF-1的表达明显下调,通过流式细胞术检测M2型细胞的比例明显上升。用这种上清和4T1细胞共培养,迁移的4T1细胞数目明显增加。当用pEGFP-PTEN质粒转染TSN-exposed RAWs或者用200ng/ml LPS口200U/mlIFN-y同时刺激细胞,都会导致CCL2和VEGF-A的表达下降,M1型巨噬细胞的数目明显增多,4T1细胞迁移的数目明显降低。结论：4T1上清与RAW264.7细胞模拟的肿瘤微环境中,NHERF-1将PTEN募集到细胞膜上,PTEN与NHERF-1发挥协同作用,降低CCL2和VEGF-A的表达,从而抑制巨噬细胞由M1型向M2型转化。