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在不同细胞因子条件下,CD8+T细胞可分化为特性和功能不同的亚群,包括Tc1,Tc2,Tc9和Tc17等。其中Tc1,即I型CD8+细胞毒性T细胞(CD8+CTL,CD8+cytotoxic T cell)具有高细胞毒性,而Tc9和Tc17细胞在体外呈现低细胞毒性的特点。目前,使用离体分化的I型CD8+细胞毒性T细胞进行的肿瘤过继细胞治疗(Adoptive cell immunotherapy,ACT)已显示出较好的临床治疗价值。最近的研究揭示,使用肿瘤特异性Tc9细胞的过继免疫疗法在小鼠黑素瘤中比传统Tc1细胞能够产生持久性与疗效更好的抗肿瘤反应,这与Tc9细胞持久的存活特性及其在体内可向分泌IFN-γ和GzmB的Tc1样细胞转变密切相关。因此,诱导具有优良性能的Tc9细胞并将其应用于以此分化类型为导向的肿瘤过继性免疫治疗,是癌症治疗的一条有价值、有前景的新途径。本研究旨在阐述IL-36γ对Tc9分化的影响,研究其促进Tc9分化的机制进行,并探讨IL-36γ促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继免疫治疗中的作用及机理。第一部分IL-36γ促进Tc9细胞分化效应及其机制的研究[目的]研究IL-36γ对Tc9细胞分化的促进作用,并进一步探讨其潜在的分子机制。[方法]磁珠分选小鼠CD8+T细胞,在Tc1、Tc9(分化条件:TGF-β+IL-4)和Tc9+IL-36γ(分化条件:TGF-β+IL-4+IL-36γ)三种分化条件下体外培养12hr,利用实时荧光定量检测Tc9相关细胞因子的mRNA水平;将C57BL/6j小鼠的CD8+T细胞在体外经anti-CD3和anti-CD28刺激,采用流式细胞术和ELISA检测在TGF-β、IL-4、IL-36γ不同组合条件下及细胞因子IL-36γ浓度梯度下培养48 hr的IL-9、IL-10的表达水平;将OT-Ⅰ小鼠的CD8+T细胞在体外经抗原提呈细胞负载OVA257-264抗原肽的刺激,通过流式细胞术和ELISA检测在TGF-β、IL-4、IL-36γ的不同组合条件下及细胞因子IL-36γ的浓度梯度下培养48 hr的IL-9、IL-10的表达水平;此外,在体外培养时添加不同浓度梯度的STAT5、STAT6、NF-κB通路的抑制剂,利用ELISA检测IL-36γ促进分化的Tc9细胞的IL-9表达水平的变化,同时采用实时荧光定量PCR检测转录因子BATF、BATF3的mRNA水平。[结果]细胞因子IL-36γ能显著提高Tc9相关细胞因子的IL-9、IL-10、IL-17a mRNA的表达;IL-36γ的加入并不会提高IL-4 mRNA的表达,表明其直接促进了 Tc9细胞分化;在体外经anti-CD3和anti-CD28刺激或抗原提呈细胞刺激时,IL-36γ均可替代经典分化条件中的IL-4,显著提高IL-9的表达和分泌;在经典分化条件即TGF-β联合IL-4基础上进一步加入IL-36γ时,IL-9和IL-10蛋白水平的表达均显著提高;分别阻断STAT6、STAT5、NF-κB信号通路,均抑制了 IL-36γ促进Tc9细胞的分化作用;此外,IL-36γ刺激上调了 Tc9分化相关转录因子BATF、BATF3 mRNA表达水平。[结论]细胞因子IL-36γ能显著促进Tc9细胞的分化,上调其相关细胞因子IL-9、IL-10等的表达水平,该促进作用在一定程度上依赖于STAT6、STAT5和NF-κB信号通路,并可能与转录因子BATF、BATF3表达水平的增加密切相关。第二部分IL-36γ促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继免疫治疗中作用及其机制的研究[目的]研究IL-36γ促进分化的Tc9细胞对小鼠黑色素瘤过继免疫治疗的作用及其机制。[方法]在CD45.1小鼠右侧腹部皮下接种B16-gOVA细胞从而构建小鼠肿瘤模型;在肿瘤注射第4天时,对小鼠肿瘤接种部位的对侧腹腔注射环磷酰胺(CTX)来暂时性清除小鼠体内的淋巴细胞,第5天时在肿瘤的同侧腹腔分别注射经体外培养48 hr形成的Tc1、Tc9和Tc9+IL-36γ细胞;从第3天开始,每隔一天测量小鼠肿瘤的大小,并观察小鼠的生存情况;在过继治疗14天,通过流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏、肿瘤引流淋巴结和肿瘤组织中的外源性和内源性CD8+T细胞及其记忆性表型、免疫卡控点分子等表达。[结果]与经典Tc9细胞相比,IL-36γ促进分化的Tc9细胞能够明显抑制黑色素瘤的进展。在过继治疗的第14天,与经典Tc9细胞相比,经IL-36γ促进分化的Tc9细胞在小鼠体内的比例明显增加;IL-36γ促进分化的Tc9细胞在体内表达较低水平的免疫卡控点分子CD244、PD-1和KLRG-1;IL-36γ促进分化的Tc9细胞在体内的记忆表型与经典Tc9细胞基本保持一致;经抗原刺激后,IL-36γ促进分化的Tc9细胞与经典Tc9细胞一样均表达较高水平的IFN-γ和Granzyme B。[结论]与经典Tc9相比,IL-36γ促进分化的Tc9具有更好的肿瘤过继免疫治疗效果,其在体内维持较高的数量并低表达免疫卡控点分子CD244、PD-1和KLRG-1。过继转移至体内后,IL-36γ促进分化的Tc9保持了与经典Tc9基本一致的记忆表型及高表达IFN-γ和Granzyme B的Tc1样特征。研究IL-36γ促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继免疫治疗中的作用及机理,能够为诱导具有优良性能的Tc9细胞、并应用于肿瘤过继性免疫治疗中奠定坚实的理论基础。比起传统的Tc1细胞的肿瘤过继免疫治疗,IL-36γ促进分化的Tc9细胞或许有着更大的临床治疗前景,值得我们进一步探索。