论文部分内容阅读
现今,由于工农业的发展和人民生活水平的提高,持久性污染物以及内分泌干扰物等小分子物质污染水体的现象日趋明显。这类物质会对人们的健康产生长远不良的影响。快速准确地检测水体中的小分子污染物显得尤为重要。通常,这类物质的免疫原性弱,通过传统的基于抗体的免疫检测难度较大。适配体（又称适体）,作为一类新型的识别分子,是通过体外筛选获得的一种单链寡核苷酸,即RNA或者单链DNA（Single-Stranded DNA,ssDNA）。适体不仅具有和抗体相似的亲和力和特异性,而且靶标范围广、稳定性好、便于修饰,其体外筛选和合成也更方便。近年来,关于各种小分子物质适体的筛选和应用层出不穷,适体在水体小分子污染物的分析检测方面也刚崭露头角。本论文以水体中三种水体小分子污染物为研究对象,运用改进的固定及非固定靶标的配体指数富集系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）筛选其ssDNA适配体,并结合磁珠分离技术和便携式血糖仪,建立了一种便携式水体小分子污染物的检测新方法,为丰富和提高水体小分子污染物的检测和监控技术提供了新思路和新方法。首先,我们发明了一种新型的基于凝胶的适体和靶标相结合的方法。我们利用3D打印技术打印出用于配置凝胶的模型,以小分子靶标为研究对象,发明的追逐扩散法成功地实现适体与小分子靶标结合的可视化,藉此在SELEX全过程逐轮监测候选适体序列的富集趋势。该方法可非常方便地用于适体筛选过程中的文库监测,尤其是针对小分子靶标的适体筛选。该发现可以为后续小分子靶标的适体筛选提供参考与借鉴。其次,分别利用两种基于磁珠的SELEX方法筛选DDT代谢物DDA的适体。在磁珠偶联靶标筛选（固定靶标）中,经过9轮的筛选获得了富集文库,但经过进一步的表征发现,候选适体与靶标DDA分子的亲和力不强,从而改用Capture-SELEX技术。在采用Capture-SELEX法（非固定靶标）筛选过程中,经过十三轮筛选,我们获得了DDA的ssDNA适体（被命名为DDA08）,并通过适体识别以及SYBR Green I（SGI）法验证了筛选得到的适体与DDA的亲和力（平衡解离常数为3.9 nM）和特异性,结果揭示获得的适体具有在实际样品如水生生物产品中检测DDA分子的可行性。第三,分别利用Nitrocellulose（NC）法（固定靶标）和Capture-SELEX结合诱变PCR法（非固定靶标）筛选全氟辛酸（Perfluorooctanoic acid,PFOA）的适体。在NC膜固定靶标法中,合成BSA-PFOA用于固定PFOA于NC膜,经过13轮的筛选获得了富集文库,但经过进一步的表征发现,获得的候选适体对BSA以及BSA-PFOA均有结合。综合分析发现,获得的适体是BSA的适体,因此,我们认为该方法不适合PFOA分子的适体筛选。在Capture-SELEX法中,经过5轮靶标筛选,我们发现文库并没有得到有效的富集,随后我们引入了诱变PCR技术,该技术可以增加文库的库容量。诱变后继续筛选11轮获得了PFOA的ssDNA适体,并通过SGI和追逐扩散验证了筛选得到的适体具有应用于PFOA检测的亲和力和潜力。第四,利用Capture-SELEX筛选o,p’-DDT的适体。利用该方法,经过13轮的筛选获得了富集文库,经过测序获得了o,p’-DDT的ssDNA适体,并从中选择了3条（共17条）进行了SGI实验表征。荧光强度最强的候选适体（被命名为DDT13）被选为后续的进一步研究。其亲和力达到412.3±124.6 nM,并且展出了良好的选择特异性。同时,该适体在实际水体样品（湖水和自来水）中仍然具有生物活性。综合结果证明本实验筛选得到的适体具有应用于检测o,p’-DDT的亲和力、特异性以及在实际水体样品中的可行性。第五,建立基于血糖仪的便携式适体分析方法。首先,将通过CaptureSELEX筛选得到的o,p’-DDT适体和蔗糖酶进行化学偶联,其次,利用氨基磁珠捕获适体的互补DNA链,最后将两者组装在一起构建检测系统。通过靶标诱导产生构象变化,使蔗糖酶适体复合物从磁珠上脱落,通过催化蔗糖转化为葡萄糖信号的检测原理,建立了一种检测o,p’-DDT的适体便携式检测法。靶标浓度在0-0.5μM范围内具有良好的线性关系。综上所述,本论文发明了一种基于凝胶的监测适体和靶标相结合方法,并通过优化和尝试固定及非固定靶标的SELEX方法筛选了DDA,PFOA以及o,p’-DDT的适体,获得的适体具有高亲和力和特异性;同时,也证明了Capture-SELEX是最为适合小分子靶标适体筛选的方法。最后,利用磁分离技术,蔗糖酶和血糖仪构建了便携式适体传感器,用于o,p’-DDT的检测。本研究为开发水体小分子污染物检测的新技术和相关产品提供了良好的技术支持。