论文部分内容阅读
目的：
1.检测动脉粥样硬化(AS)患者血清中成纤维生长因子21(FGF21)表达水平,探讨AS对FGF21表达水平的影响。
2.采用致AS因子处理血管内皮细胞,检测FGF21表达水平变化,探讨体外实验中致AS因子对血管内皮细胞FGF21表达水平的影响。
3.研究血管内皮细胞和巨噬细胞在FGF21刺激下,动脉粥样硬化相关因子对氧磷酶1(PON1),肝细胞核因子(Foxa2)表达量的变化。
4.研究FGF21对紫杉醇诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用,从而探讨FGF21对AS的作用。
方法：
1.检测AS患者血清中FGF21水平收集动脉粥样硬化患者和正常健康人血清标本,通过酶联免疫吸附法(Elisa)检测患者和正常健康人血清中FGF21水平,并比较两者水平差异。
2.通过细胞白介素-6(IL-6)和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)作用血管内皮细胞,检测细胞FGF21水平变化。
1)血管内皮细胞分成三组:IL-6处理组；ox-LDL处理组；IL-6+oxLDL处理组。每组中空白对照组为只加DMEM完全培养基组。
2)各组处理因素分别作用细胞12h,24h,48h后,酚.氯仿法提取细胞RNA,逆转成cDNA,扩增后,加入FGF21引物进行real-time PCR。
3)分析比较各组FGF21 mRNA水平差异
3.检测FGF21对PON1,Foxa2表达量的影响
1)血管内皮细胞用不同作用时间FGF21(50ng/ml)处理:12h,24h,48h。对照组细胞只加DMEM完全培养基。
2)收集细胞RNA,逆转录后加入PON1引物,Foxa2引物进行real-time PCR检测PON1 mRNA表达水平。
3)血管内皮细胞用不同浓度FGF21处理:0,6.25ng/ml,12.Sng/ml,25ng/ml,50ng/ml,100ng/ml。对照组细胞只加DMEM完全培养基。
4)作用24h后,收集细胞RNA,逆转录后加入PON1引物和Foxa2引物进行real-time PCR,检测PON1 mRNA表达水平。
5)血管内皮细胞用不同浓度FGF21处理:0,6.25ng/ml,50ng/ml。RIPA(含1％PMSF)裂解液提取细胞蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度后,采用western blot检测蛋白水平。
6)巨噬细胞用不同浓度FGF21处理:0,6.25ng/ml,50ng/ml。RIPA(含1％PMSF)裂解液提取细胞蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度后,采用western blot检测蛋白水平。
4.FGF21对紫杉醇诱导血管内皮细胞凋亡的保护作用
1)紫杉醇对血管内皮细胞的凋亡敏感性比较。血管内皮细胞用不同浓度紫杉醇出处理:0,10-7mol/L,0.5x10-6 mol/L,10-5mol/L,10-4 mol/L。酶联免疫检测仪检测吸光度,筛选出紫杉醇诱导细胞凋亡的最佳浓度。
2)筛选出合适紫杉醇浓度后,将血管内皮细胞分成三组:紫杉醇处理组；6.25ng/ml FGF21+紫杉醇处理组；50ng/ml FGF21+紫杉醇处理组。对照组为加DMEM完全培养基培养组。每组三个样本。
3)提取细胞蛋白,通过caspase3试剂盒检测各组细胞caspase3活性。观察FGF21对紫杉醇诱导细胞凋亡的保护作用,及不同浓度FGF21对细胞凋亡保护程度差别。
4)提取细胞蛋白,easpase8试剂盒检测各组细胞easpase8活性。观察FGF21对紫杉醇诱导细胞凋亡的保护作用,及不同浓度FGF21对细胞凋亡保护程度差别。
结果：
1.与正常健康组相比,AS患者血清内FGF21水平明显升高。
2.(1)IL-6处理组中,FGF21 mRNA表达量具有时间依赖性。mRNA水平在12h时高于对照组,而在48h时表达量显著升高,(P<0.01),是对照组的36倍。
(2)ox-LDL处理组中,细胞经ox-LDL作用不同时间段后,与对照组相比,FGF21 mRNA表达量均上升,并在24h时达到最高值。
(3)ox-LDL+IL-6处理组中,ox-LDL+IL-6处理后FGF21 mRNA表达量均高于对照组,其中处理时间为24h时,mRNA表达量最高,是对照组的144倍。
3.(1)血管内皮细胞用50ng/ml FGF21处理不同时间后,PON1和Foxa2 mRNA表达量变化呈时间依赖性。
(2)血管内皮细胞用不同浓度FGF21处理24h后,PON1和Foxa2 mRNA表达量变化呈剂量依赖性。
(3)血管内皮细胞经两种浓度FGF21(6.25ng/ml,50ng/ml)处理后,PON1蛋白表达量均高于对照组,且在50ng/ml浓度时蛋白表达量高于6.25ng/ml时。
(4)巨噬细胞经两种浓度FGF21(6.25ng/ml,50ng/ml)处理后,HUVECs组PON1蛋白表达量6.25ng/ml浓度时蛋白表达量高于对照组。
4.(1)细胞经紫杉醇(5×10-6mol/L)处理后,caspase-3和caspase-8活性明显高于对照组,说明已成功建立细胞凋亡模型。
(2)FGF21处理细胞后,caspase-3和caspase-8活性均低于只加紫杉醇处理组,且随着加入的FGF21浓度升高,活性进一步降低。
结论：
1.AS状态下,FGF21水平升高,并且随着疾病的发展FGF21水平也升高。推测可能是机体对疾病的代偿性功能。所以,FGF21可能对AS有调节作用。
2.FGF21能上调抗动脉粥样硬化因子PON1,Foxa2表达量。
3.FGF21能保护在AS发展过程中起重要作用的血管内皮细胞凋亡。
4.FGF21对AS的影响可能与内皮细胞PON1,Foxa2,凋亡因子等的表达有关。