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非酒精性脂肪肝疾病(Non-alcholic fatty liver diseases,NAFLD)是一类由于机体代谢紊乱造成的以肝脏细胞脂质积累为主要临床特征的疾病,被认为是代谢综合征(Metabolicsyndrome,MS)在肝脏中的表现。NAFLD早期表现为单纯性脂肪变性(simple steatosis);但NAFLD 一旦进展为非酒精性脂肪肝炎(steatohepatitis,NASH)能不可逆地向肝纤维化(fibrosis)、肝硬化(cirrhosis)甚至肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma)恶变。NAFLD的发生发展受环境、遗传、代谢应激等多因素影响;其中胰岛素抵抗和炎症反应是NAFLD发生发展中的两个关键因素,协同发挥作用。目前认为,控制脂肪肝向NASH进展是干预此类疾病的关键节点;而理解疾病进展的分子机理,特别是阐明胰岛素抵抗和炎症反应在其中的调控机制,对于开发新的治疗药物将起关键的作用。本实验室在研究NAFLD发生机制中发现E3泛素连接酶与肝脏脂肪变性密切相关,而驱动NASH发生的关键因素炎症反应是受到泛素化系统严格调控的。因此,我们推测TRIM8参与调控NAFLD的发生,本文着重探讨了 TRIM8在NAFLD发生中的功能及其作用机制。首先,我们验证了 TRIM8与NAFLD的相关性。我们发现TRIM8蛋白表达水平在NAFLD病人样本中显著升高,并且其表达量与病变程度呈正相关性。TRIM8表达上调也在经高脂饮食(High Fat Diet,HFD)诱导的小鼠肝脏脂肪变性模型以及瘦素基因缺陷的ob/ob小鼠肝脏脂肪变性遗传学模型中得到证实。我们还利用棕榈酸(Palmitate)诱导小鼠原代肝细胞的脂肪积累,伴随脂肪的积累TRIM8蛋白表达量呈递增趋势。所有这些观察表明,TRIM8的表达上调是与肝脏脂肪变性密切相关的,TRIM8可能参与调控NAFLD的发生。其次,我们揭示了 TRIM8加重肝脏胰岛素抵抗的功能。我们构建了肝细胞特异性的TRIM8过表达(TRIM8-HTG)和敲除(TRIM8-HKO)小鼠,并通过HFD饲养诱导胰岛素抵抗。我们发现经HFD饲养的对照组NTG和TRIM8-HTG转基因小鼠的体重、血清空腹血糖和胰岛素水平都比相应的正常饮食小鼠明显升高。与对照小鼠相比,HFD条件下TRIM8-HTG小鼠的空腹血糖及胰岛素水平增高更加明显,但是体重并无明显差异。在葡萄糖耐受实验以及胰岛素耐受实验中,TRIM8-HTG小鼠的血糖水平均显著高于对照小鼠。我们进一步检测了胰岛素信号通路和相关分子的表达及磷酸化水平,结果表明TRIM8肝脏特异性过表达能够显著削弱p-IRS1Tyr608、p-AKTSer473以及p-GSK3β,明显降低糖异生关键酶PEPCK和糖原合成关键酶G6Pase的表达。与TRIM8-HTG小鼠相反,肝细胞条件性敲除TRIM8-HKO的小鼠经HFD饲养后呈现减轻的表型。所有这些结果表明,TRIM8表达上调加重高脂饮食诱导的肝脏胰岛素抵抗。再次,我们证明了 TRIM8加重肝脏脂肪变性、炎症反应以及纤维化的功能。我们发现HFD饲养的TRIM8-HTG小鼠肝脏比对照小鼠明显增大,TRIM8-HKO小鼠则比对照小鼠明显偏小。油红O染色以及肝脏内甘油三脂、总胆固醇、非酯化脂肪酸、肝功能等检测均表明TRIM8能够明显加重肝脏内脂肪的积累和肝脏损伤。定量RT-PCR检测则显示TRIM8能够促进IL-6、TNFα、MCP1等炎症因子和趋化因子的表达,抑制抗炎症因子IL-10的表达。免疫荧光染色实验发现TRIM8能够促进F4/80阳性的炎症细胞浸润到肝脏,加重肝脏纤维化的病变程度。与TRIM-HTG小鼠相反,TRIM8-HKO小鼠在脂肪积累、肝功能、炎症反应、纤维化等方面都显示比对照小鼠减轻的表型。这些结果表明,TRIM8能显著促进HFD诱导肝脏脂肪变性、炎症反应和纤维化的过程;TRIM8表达上调可能是推动肝脏脂肪变性向NASH发展的重要因素。我们进一步明确了 TRIM8促进胰岛素抵抗和NASH发生的作用机制。我们发现TRIM8过表达显著提高了 JNK和p38蛋白的磷酸化水平,但是对ERK的激活并没有影响。检测MAPK信号通路的上游激酶显示TAK1但不是MEKK1或ASK1的活性能被TRIM8显著改变。同时,TAK1特异性抑制剂5Z-7-OX,能完全阻断TRIM8加重HFD诱导的胰岛素抵抗的效应。最重要的是,5Z-7-OX几乎能完全抑制了 TRIM8对肝重、脂质积累、炎症反应以及肝功能异常的正调控作用。我们的研究结果表明,TRIM8通过TAK1激活JNK和p38促进HFD诱导的胰岛素抵抗和NASH发生。最后,我们阐释了 TRIM8与TAK1相互作用促进TAK1泛素化的分子机制。我们发现棕榈酸刺激促进TRIM8从细胞核移位到细胞质中并与TAK1共定位,免疫共沉淀实验进一步证实棕榈酸刺激能够增强二者之间的相互作用。我们进一步定位了 TRIM8蛋白中第59-182位氨基酸肽段和TAK1蛋白中第301-480位氨基酸肽段是介导二者相互作用的,并且两者相互作用是TRIM8泛素化TAK1所必需的。最重要的是干预TRIM8与TAK1互作能阻断TRIM8对TAK1泛素化的作用,并完全逆转TRIM8过表达增强HFD诱导的胰岛素抵抗以及NASH表型的效应。我们的研究结果阐释了 TIRM8与TAK1相互作用并泛素化TAK1增强HFD诱导胰岛素抵抗和NASH发生的分子机制。综上所述,TRIM8作为E3泛素连接酶TRIM家族中的一员,不仅在天然免疫中发挥重要作用,而且通过泛素化TAK1激酶调控下游信号通路中JNK、p38的磷酸化,从而调控NAFLD以及相关代谢性疾病的发生。我们的研究进一步完善了非酒精性脂肪肝疾病的发病机制,为NAFLD临床诊断及治疗提供新的靶标。