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背景与目的:急性髓系白血病（Aacute myelocytic leukemia,AML）是一类由于造血干细胞/祖细胞异常增殖和分化引起的高度异质性血液系统恶性肿瘤,其恶性度高,进展迅速,绝大多数患者不能通过化疗方案治愈,5年总生存率不足50%。目前亟需深入探索AML的相关生物学机制,以便为疾病诊断及治疗提供更有力的依据。微小RNAs（MicroRNAs,miRNAs）是一类短链非编码的单链RNA,它参与调控靶基因表达,多途径影响细胞的增殖、分化、代谢、衰老及死亡等生物学行为,对肿瘤细胞生长起到促进或抑制作用,其分子机制的探索为研发新的靶向治疗药物提供了新的方向。近年来,铁死亡、自噬性死亡等新型调节性细胞死亡过程的发现,为恶性肿瘤的治疗开辟了新的路径。自噬是机体通过清除细胞受损蛋白质及细胞器,维持机体内环境稳定的一种细胞活动过程。铁死亡是由于细胞内铁离子过度积累,伴随着活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）失衡、细胞膜脂结构过氧化、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）耗竭而引起的一种细胞死亡方式。研究表明,自噬在铁离子转运过程中发挥着至关重要的作用,它对铁死亡调控的平衡点是当前研究的热点。miRNAs在AML发生发展中的作用已逐渐得到重视,但其机制研究仍有待进一步深入,了解AML细胞的死亡形式及其影响因素对开拓AML治疗的新前景具有重要意义。本研究旨在探究miR-20b-5p通过调控自噬参与促进AML细胞抵抗铁死亡的相关机制,为AML的靶向治疗提供新策略。研究方法:1、通过GEO数据库筛选与AML相关的miRNAs数据集,联合TCGA数据库分析miR-20b-5p等基因在AML患者中的表达情况;应用Kaplan-Meier法进行miR-20b-5p表达相关的患者生存曲线分析;利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR,RT-PCR）实验检测miR-20b-5p在AML患者及AML细胞（THP-1、Kasumi-1、KG-1、TF-1细胞）中的表达情况,根据结果选择进行后续实验的细胞株。2、应用卡方检验分析miR-20b-5p表达与AML患者年龄、性别等临床信息的相关性。3、利用CCK-8细胞增殖实验检测抑制miR-20b-5p表达和/或加入阿糖胞苷（Cytarabine,Ara-c）后AML细胞的活性变化。4、根据TCGA数据库中AML患者的miR-20b-5p表达情况将数据分为高、低表达两组,匹配得出差异基因,通过KEGG以及GO通路进行功能分析,明确miR-20b-5p的相关通路,并通过GSEA进行分析验证。5、通过蛋白免疫印迹（Western Blot）、免疫荧光实验检测抑制miR-20b-5p表达或联合Ara-c/Ara-c+去甲柔红霉素（Idarubicin,IDA）后AML细胞中自噬核心蛋白LC3的表达情况,并应用透射电镜观察自噬小体数量。6、Western blot实验检测抑制miR-20b-5p表达或联合Ara-c后AML细胞中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic Target OfRapamycin,m TOR）、磷酸化m TOR（p-m TOR）蛋白的表达情况。7、RT-PCR实验检测抑制miR-20b-5p表达后AML细胞自噬相关基因Beclin1、ATG3、ATG4、ATG5、ATG7、ATG9、ATG10及ATG12的表达情况,应用western blot实验检测抑制miR-20b-5p表达后Beclin1蛋白的表达情况,应用Pull down实验、双荧光素酶报告实验验证miR-20b-5p靶向作用于Beclin1基因。8、铁死亡抑制剂（Ferrostatin-1,Fer-1）处理抑制miR-20b-5p表达或联合Ara-c/Ara-c+IDA后的AML细胞,应用CCK-8实验检测细胞活性变化。9、抑制miR-20b-5p表达和/或联合Ara-c/Ara-c+IDA后,应用钙黄绿素乙酰氧基甲酯荧光探针检测AML细胞铁离子的表达水平;脂质过氧化试剂盒检测丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的表达水平;微量还原型谷胱甘肽试剂盒检测GSH的表达水平;免疫荧光实验检测ROS的表达水平,明确抑制miR-20b-5p表达及化疗药物对AML细胞铁死亡的影响。10、通过自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）处理抑制miR-20b-5p表达联合Ara-c后的AML细胞,测定细胞铁离子、MDA、ROS及GSH表达水平,评估抑制自噬对AML细胞铁死亡的影响。结果:1、GEO数据库筛选出与AML患者相关的差异表达的miRNAs数据集,联合TCGA数据库发现miR-20b-5p在AML患者中显著上调,Kaplan-Meier生存分析表明miR-20b-5p高表达患者的生存率明显低于低表达患者;RT-PCR结果表明miR-20b-5p在AML患者及AML细胞株（THP-1、Kasumi-1、KG-1、TF-1细胞）中均存在高表达,AML患者预后危险程度分层与miR-20b-5p表达高低存在相关性,预后不良组表达量显著高于预后良好及预后中等组。2、miR-20b-5p的表达水平与AML患者年龄、性别、初治白细胞数、是否为正常核型、是否伴有FLT3-ITD突变、NPM1突变及CEBPA突变均无显著相关性。3、抑制miR-20b-5p表达能降低THP-1、Kasumi-1细胞活性,联合小剂量Ara-c作用48小时能显著加强对AML细胞活性的抑制作用,并存在浓度依赖性。4、KEGG、GO通路分析以及GSEA分析均表明miR-20b-5p与细胞自噬相关。5、Western blot及荧光图结果显示抑制miR-20b-5p表达或联合小剂量Ara-c/Ara-c+IDA可显著增强THP-1、Kasumi-1细胞LC3 II蛋白表达,电镜下可见增多的自噬小体,结果表明抑制miR-20b-5p表达及联合应用化疗药物可促进AML细胞自噬。6、Western Blot实验结果表明抑制miR-20b-5p表达48小时后,THP-1、Kasumi-1细胞中p-m TOR蛋白表达水平显著降低,抑制miR-20b-5p表达24小时及48小时分别联合Ara-c,AML细胞中p-m TOR蛋白表达显著降低。7、RT-PCR和western blot实验结果表明抑制miR-20b-5p表达可以促进自噬相关基因Beclin1的表达,Pull down实验、双荧光素酶报告实验结果验证miR-20b-5p可与Beclin1靶向结合,降低Beclin1的表达水平。8、CCK-8实验检测发现抑制miR-20b-5p表达或联合Ara-c/Ara-c+IDA后的THP-1、Kasumi-1细胞活性下降,经Fer-1处理后细胞活性有所恢复。9、抑制miR-20b-5p表达联合Ara-c/Ara-c+IDA后,促进了THP-1、Kasumi-1细胞内铁离子聚集,MDA及ROS表达增加、GSH表达水平降低。10、抑制miR-20b-5p表达联合Ara-c后的THP-1、Kasumi-1细胞经3-MA处理后,细胞铁离子、MDA、ROS表达水平较对照组显著降低,GSH表达水平回升。结论:1、miR-20b-5p在AML患者及AML细胞株中存在高表达,并与不良预后呈正相关关系。抑制miR-20b-5p表达可以降低AML细胞活性,联合Ara-c能加强抑制作用。2、抑制miR-20b-5p表达可促进AML细胞自噬,联合Ara-c或Ara-c+IDA可加强促进作用;抑制miR-20b-5p表达参与调控m TOR通路,促进AML细胞自噬;抑制miR-20b-5p表达可靶向上调Beclin1基因,促进AML细胞自噬。3、抑制miR-20b-5p表达联合Ara-c/Ara-c+IDA能促进AML细胞铁离子富集、促进细胞发生铁死亡,抑制自噬能逆转由抑制miR-20b-5p表达联合Ara-c促进的铁死亡。