γ-氨基丁酸(GABA)是一种功能物质,已被广泛应用于功能性产品中,具有良好的市场前景。本课题为提高生物柴油制造业的副产物的综合利用,扩大谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的底物谱,找到了一种非粮食原料合成GABA的途径。本文通过敲除pknG(编码丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶)、gabT(编码γ-氨基丁酸氨基转移酶)、gabD(编码琥珀酸-半醛脱氢酶)和gabP(编码GABA反转运蛋白)4个基因,过表达glpF(编码甘油摄取促进蛋白)、dhaD(编码甘油脱氢酶)、dhaK(编码二羟丙酮激酶)等6个基因的基因操作技术改造C.glutamicum的代谢通路,实现了在C. glutamicum中利用甘油合成GABA的目的。本课题的主要研究内容和结果如下:(1)将质粒 pEC-XK99E-g/pFDK电转入 C.glutamicum ATCC 13032 构成菌株 TS1,进行甘油利用测定,最终OD600为12.11,对glpF、dhaD、dhaK基因进行核糖体结合位点(RBS)随机突变,通过筛选后得到质粒pEC-XK99E-g/pFDK1,将该质粒电转入ATCC13032中构成菌株TS2,对TS2进行甘油利用测定,OD600为20.1。测定DhaD活性,菌株TS1中DhaD活性是0.12U/mg,菌株TS2中DhaD活性是0.5U/mg。(2)分别构建只含有质粒pXMJ19-gad的表达菌TS3和含有质粒pXMJ19-gad和pEC-XK99E-glpFDK1的菌株TS4,通过菌株TS2、TS3和TS4摇瓶发酵来分析GABA的合成能力,只有TS4有GABA合成,GABA为2g/L,L-谷氨酸为1.27g/L,菌株TS3只合成L-谷氨酸0.04g/L。(3)构建不同RBS强度的gad基因表达菌株分别是:含高强度RBS的菌株TS5、含低强度RBS的菌株TS6。将两个菌株和对照菌TS4进行摇瓶发酵,36h后TS5菌株GABA产量比对照菌提高70%。TS6菌株GABA产量比对照菌降低54 %。菌株TS4中GAD活性为25.3U/mg,菌株TS6中GAD活性为1.7U/mg,菌株TS5中GAD活性比TS4中酶活高29.6%。(4) ATCC13032菌株中敲除pknG基因,构成菌株TS7,pEC-XK99E-glpFDK1和pXMJ19-gadH质粒转入菌株TS7得TS9菌株,将菌株TS5和菌株TS9摇瓶发酵,36h后菌株 TS9 有 4.1g/L GABA。(5)选用高强度RBS过表达ppc基因,构成菌株TS10,摇瓶发酵,36h后GABA为2.02g/L,较菌株TS9产量下降50.73%。构建含有中强度RBS过表达ppc基因菌株TS11和低强度RBS过表达ppc基因菌株TS12,将菌株TS11、TS12和TS10摇瓶发酵,36h 后菌株 TS11,GABA 产量为 4.36g/L。菌株 TS12 GABA 为 5.17g/L。(6)在菌株TS7中敲除gabTDP基因构成菌株TS13,pXMJ1 9-gadH-ppcL和pEC-XK99E-glpFDK1质粒转入菌株TS13构成菌株TS15,将菌株TS15和TS12发酵,84h后TS15产GABA为10.16g/L,较对照菌高23%。在菌株TS15中过表达gadC基因构成菌株TS16,将菌株TS16和TS15进行摇瓶发酵,84h后菌株TS16,GABA为10.94g/L,较对照菌高7.7%。