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背景:原癌基因Bmi-1(B-cell specific moloney muriney murine leukemia virus insertion site 1)是多梳基因(Polycomb Group genes,Pc G)家族的关键成员之一。其在多种恶性肿瘤中呈高表达水平,如慢性髓细胞白血病(Chrorlic myeloid leukemia,CML)等。据报道,Bmi-1与肿瘤干细胞的增殖、分化、多药耐药以及放化疗的敏感性密切相关,是导致化疗失败及肿瘤复发的重要因素之一。最新的研究证明,Bmi-1在放疗过程中导致的DNA损伤反应应答(DNA damage response,DDR)中发挥了重要的作用,它可以增强DNA损伤的修复能力及抑制DNA损伤检验点的激活。同时,在实体肿瘤中,Bmi-1可参与放化疗导致的DDR。但在白血病中,Bmi-1是否可调控化疗药物导致的DDR,以及其如何调控DNA损伤检验点的生物学机制还有待明确。此课题选用慢性髓细胞白血病多药耐药细胞株(K562/ADR)作为实验对象,利用能导致DSBs的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂,即抗肿瘤中药单体-喜树碱(Camptothecin,CPT),和小干扰RNA(siRNA)技术,来探究沉默Bmi-1基因是否增强了CPT导致的DNA损伤反应应答及细胞DNA损伤检验点的调控,并最终抑制白血病细胞的增殖,起到增加化疗药物作用于白血病细胞的敏感性,并进一步探讨其可能的生物学机制。方法:1.用RT-PCR和Western blot的方法比较K562/W和K562/ADR组细胞Bmi-1的表达情况。2.将实验室前期设计好的siRNA序列p Genesil-2-HK、p Genesil-2-Bmi-1 1以及p Genesil-2-Bmi-1 3分别瞬时转染至K562/ADR细胞株中,48h后检测Bmi-1基因的表达,并分别命名为K562/ADR-Ctr、K562/ADR-S1、K562/ADR-S3。同时,我们把含有EGFP基因,能表达荧光蛋白的质粒p Genesil-1(由武汉晶赛生物工程技术有限公司提供)转入细胞后,通过荧光显微镜观察转染效率。3.选用0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08及0.16μmol/L的CPT药物浓度处理K562/ADR细胞1-4天,应用MTT法检测出K562/ADR细胞对于CPT的最适药物浓度及加药时间。4.用选取好的最适浓度及加药时间(72h IC50:0.016μmol/L)的CPT处理K562/ADR及K562/ADR-s1细胞,用MTT法检测1-5天K562/ADR、K562/AD-R-s1、K562/ADR+CPT及K562/ADR-s1+CPT四组细胞的增殖情况。5.CPT(0.016μmol/L)处理K562/ADR及K562/ADR-s1细胞2h,收获四组细胞,通过免疫荧光实验观察细胞中DSBs的标志物——γ-H2AX的细胞核聚焦点数。6.Western blot方法检测四组细胞中DNA损伤反应蛋白——P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX蛋白表达情况。7.Western blot方法检测ATM激活剂(ATM activator)——Chloroquine diphos-phate(72h,0.014μmol/L)处理的K562/ADR细胞中的P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX蛋白表达情况。8.Western blot方法检测ATM抑制剂(ATM Kinase Inhibitor)——KU55933(72h,10μmol/L)处理的K562/ADRs1细胞中的P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX蛋白表达情况。结果:1.K562/ADR细胞Bmi-1的表达量高于K562/W细胞,选取高表达Bmi-1的K562/ADR细胞株用于后续实验。2.观察到p Genesil-1的转染效率在70%左右,且两种siRNA序列成功下调了Bmi-1的表达,选取沉默效果较好的干扰株K562/ADR-s1进行后续实验。3.K562/ADR对于CPT呈现了剂量和时间的依赖性,并有效的抑制了细胞的增殖,且计算出72h IC50值用作后续实验。4.观察四组细胞的增殖情况,发现K562/ADR-s1及K562/ADR+CPT组细胞增殖率较K562/ADR组明显降低,K562/ADR-s1+CPT组的细胞增殖率较K562/ADR、K562/ADR-s1及K562/ADR+CPT组细胞降低的更明显,说明干扰Bmi-1后能够加强化疗药物CPT导致的K562/ADR细胞的增殖抑制作用,增加了CPT作用于K562/ADR细胞的敏感性。5.观察四组细胞,发现K562/ADR-s1及K562/ADR+CPT组都有不同程度的γ-H2AX细胞核聚焦点数的存在,在K562/ADR-s1+CPT组中γ-H2AX细胞核聚焦点数较K562/ADR-s1及K562/ADR+CPT组增多,说明干扰Bmi-1后加强了化疗药物导致的DSBs。6.K562/ADR-s1及K562/ADR+CPT组细胞P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX蛋白表达量均增多,而K562/ADR-s1+CPT组中的P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX表达与K562/ADR-s1及K562/ADR+CPT组比较均有明显的增高。7.加了ATM激活剂组细胞P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX蛋白的表达较K562/ADR组细胞明显增高。8.ATM抑制剂组细胞P-ATM、P-CHK2及γ-H2AX蛋白的表达明显低于K562/ADR-s1组细胞。结论:沉默Bmi-1基因能够增强K562/ADR细胞对化疗药物CPT的敏感性,可能与其增强CPT导致的DNA损伤反应蛋白P-ATM的活性,从而激活DNA损伤检验点有关。