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背景： 创伤性脑损伤后的脑组织损害是由于直接机械性损伤和涉及许多生化物质改变的继发性损害所引起。大量资料表明创伤性脑损伤可导致神经细胞凋亡的发生，并且细胞凋亡在脑创伤后神经细胞功能退变和数量衰减等方面起非常重要的作用，因此研究引起凋亡的分子机理可能为脑创伤提供新的治疗前景。业已知道很多信号分子参与调节细胞的凋亡过程，如蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、蛋白酶caspase等，但引起脑创伤后神经细胞凋亡的信号转导机理仍未阐明。MAPKs是一组普遍存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与调节多种信号转导通路，在细胞生长、分化甚至凋亡中占据核心地位。目前已鉴定出的MAPKs，主要包括细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）、p38激酶、c-Jun氨基末端蛋白激酶（c-JunN-terminal protein kinase，JNK）、ERK5。有研究表明从鼠PC12细胞中撤离神经生长因子会引起p38、JNK的持续激活和ERK的抑制，并导致细胞调亡；认为p38、JNK的激活和同时出现的ERK抑制是引起PC12细胞凋亡的关键。最近亦有报道缺血性脑损伤后p38、JNK活性增高，p38拮抗剂SB203580可减少神经细胞凋亡。在神经元和PC12细胞中，显性负性c-Jun突变体的表达可以抑制凋亡。这些证据提示了p38和JNK信号通路与神经细胞凋亡有关，但创伤性脑损伤后伤侧大脑皮质p38和JNK活性变化还未见报道。尽管脑创伤可引起神经细胞凋亡，但细胞凋亡的发生机理并未完全弄清。实验发现在许多细胞中Fas与其配基FasL（Fas ligand）相互作用可导致凋亡性细胞死亡，然而脑创伤后Fas/FasL涉及细胞凋亡的研究却相对较少。基因的表达受转录因子调控，而MAPKS信号通路的核目林就是相关转录因于，但脑创伤后 p38和 JNK能否调节FasL基因表达还没有得到验证。在中枢神经系统，PKC激活可导致许多细胞内蛋白的磷酸化，启动和调节多种信号转导途径。实验发现p＊C桔抗剂在脑缺血时对神经细胞具有保护作用，认为P＊C激活可能在神经细胞凋亡中起作川。NO作为一fI个i＊分－厂，具有多种生物学功能，据报道NO或者是保护神经或者是神经毒作用；近年发现，在许多细胞系列，包括神经细胞在内，NO的作用与凋亡的发生密切相关。这些资料证明了 PKC的激活和 NO的过度释放可能参与调节细胞凋亡过程。创伤性脑损伤后caspase刁的激活通过裂解其特异性底物，导致细胞凋亡的发生，但 PKC和 NO能否通过激活 caspase刁诱导神经细胞凋亡仍知道较少，特别是 p3 8和 J－NK是否参与 PKC和 NO的研究更少。目的： l．探索脑创伤后p38和 J－NK活性的变化规律。 2．探索脑创伤后活化p38和川K引起继发性神经细胞死亡的途 径。 3．探索 p38和 WK是否参与 PKC或NO诱导 PC12细胞凋亡的过 程及其作用通路。本实验分三部分探讨p38和NK介导神经细胞凋亡的作用和调控机理 第一部分脑创伤后p38和JNK活性变化及其作用机理 以前对 P3 8和 JNK的调控和功能研究大多来自体外细胞培养实验，而创伤性脑损伤后活体神经细胞应激反应时p％和N K的活性变化以及它们的下游作用因子还未见研究。为阐明脑创伤后的信号转导通路，本实验从下列水平检测了信号转导链：①p38和 JNK的活性，②AP刁DNA结合活性，③FasL蛋白表达。方法： 1．SD雄性大鼠70只，体重250士309，随机分成假损伤组和伤后1、3。6、12。24。72h组，每组 10 ／q。 2．以自山落体装置制作左J页1汁局限性脑挫裂伤模型，假损伤组仅开骨窗，不致脑损伤。 3．脑组织作spin的冠状切片，用FasL免疫组化试剂盒检测FasL蛋白表达。 4 4．用 P38和 NK激酶活性检测试剂盒分析伤侧皮质全细胞相提液中 p3 8和 NK的活性。 5．用［Y－’冈末端标记的 AP刁共性寡核苦酸探针检测核蛋白 APIDNA结合活性；此外使用抗C－F。S或抗C－Jllfl抗体进行超迁移分析，以检测AP刁复合体中是否含有cFos和 c刁n。结果： 1．脑创伤后 lh伤侧皮质 FasL表达开始增加，伤后 24h达高峰，伤后72h开始下降，但仍高于正常。 2．伤侧皮质 JNK活性于脑创伤后 l、3。6、12、24、72h为正常值的1．18（＜0刀5）、2．23（p＜0刀1）、5．16（＜0刀1）。4．28（p＜0刀1）、4．sl（p＜0＊1）、3．11（p＜0＊1）倍；伤狈皮质p38活性于脑创伤后厂3、6、12、24、72h为下常值的1．13（＞0．05）、2，83（＜0．01）。3．69（l）＜0．of)、3．12（＜0＊1）、2．5＊p＜0＊1)。1＊8倍…0＊5)。 3．核蛋白粗提液与’午标记的共性APJ寡核昔酸孵育，导致一条宽的迁移带出现，损伤组AP－IDNA结合活性明显高于假损伤组；加用抗c＊Fos或抗c－Jun抗体减少了宽带的密度，并且两?