论文部分内容阅读
本实验室前期先后完成了多种药物多肽/蛋白基因与人血清白蛋白(HSA)基因的融合，并在甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris)中成功分泌表达。但在研究中发现，毕赤酵母在分泌HSA及其融合蛋白时，HSA及其融合蛋白的表达量，以及降解条带都表现出了相当程度的差异；且同一种药物蛋白分别连在HSA的N-端和C-端，表达量和降解情况也表现出一定的差异。本研究选择实验室较成熟的人血清白蛋白/干扰素β(HSA/IFNβ)融合蛋白为研究对象，使用基因工程手段对其分泌表达进行了改良。本研究利用基因工程技术对毕赤酵母分泌途径进行改造，选取毕赤酵母蛋白分泌途径的几种辅助因子：分子伴侣BiP，二硫键异构酶PDI，与PDI再生相关的氧化还原酶Ero1，以及囊泡转运过程中相关的Sec1和Sly1，在融合蛋白表达菌株GS115/pPIC9K-HSA-IFNβ中进行组成型共表达。结果显示，共表达各种蛋白分泌辅助因子不会影响重组菌株的正常生长；共表达PDI，Ero1，Sec1和Sly1分别使融合蛋白HSA/IFNβ的表达量提高了50-90%，而共表达BiP对融合蛋白的表达量无显著影响。同时，研究了在HSA与IFNβ之间插入不同连接肽对毕赤酵母表达融合蛋白的影响。根据连接肽分子长短和结构等设计了四种不同性质的连接肽：RL、HL、SL和LL。结果显示，较短并具有刚性结构的连接肽RL可以显著提高融合蛋白表达量(对照菌株的2.2倍)；较长的LL对融合蛋白表达量几乎无影响；而在HSA与IFNβ之间插入另两种连接肽HL和SL会降低融合蛋白表达量(约下降30%)。各种连接肽的插入对于融合蛋白的降解并没有明显缓解，插入HL和SL甚至使得HSA/IFNβ融合蛋白更易于降解。论文还对宿主毕赤酵母胞内蛋白酶系统进行了改造，并将融合蛋白HSA/IFNβ在蛋白酶yps1Δpep4Δ双缺陷菌株中进行了表达分析。蛋白酶基因YPS1&PEP4的敲除对重组毕赤酵母的生长和融合蛋白的表达量没有显著影响，而融合蛋白在分泌表达过程中的降解得到了显著缓解，降解片段减少了68%。