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人参皂苷Compound K（CK）是人参中具有抗肿瘤、抗炎等活性的稀有四环三萜类达玛烷型皂苷，其前体化合物原人参二醇（Protopanoxadiol，PPD）本身也具有较强的抗肿瘤和抗氧化活性。齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）是具有保肝、抗肿瘤活性的五环三萜类化合物，也是齐墩果烷型人参皂苷的前体化合物。目前，还未有利用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）异源合成三萜类化合物的报道。本论文以解脂耶氏酵母为三萜类化合物生产底盘菌株，结合合成生物学与代谢工程方法，分别从基因工程改造、代谢途径优化与适配、组学检测与分析和关键酶活性提升等角度构建并优化了分别合成人参皂苷CK和齐墩果酸的解脂耶氏酵母工程菌株。研究结果如下：
通过在解脂耶氏酵母ATCC201249中重构达玛烯二醇（Dammarenediol II，DMD）合成途径，进而将原人参二醇合成所需细胞色素P450单加氧酶PPDS及NADPH-P40还原酶ATR1共表达获得原人参二醇合成菌株；针对三萜合成过程的限速步骤，单基因和多基因水平过表达甲羟戊酸途径（MVA）及下游2，3-氧化鲨烯合成途径基因，在筛选最高原人参二醇产量菌株基础上，引入人参皂苷CK糖基转移酶UGT1后，构建重组菌株YL-CK1，人参皂苷CK摇瓶产量21.7mg/L。
通过引入mixedAS合成酶基因、细胞色素P450单加氧酶CYP716A12及其还原酶ATR1，经前体代谢途径优化，获得齐墩果酸摇瓶产量为48.1mg/L的工程菌株YL-UA/OA；通过引入β-香树脂醇（β-amyrin）合成酶bAS、CYP716A12及ATR1，并将MVA途径多基因组合过表达，经筛选工程菌株YL-OA7的齐墩果酸摇瓶产量为92.1mg/L；构建过程中针对rDNA位点片段整合方式效率偏低的缺陷，提出zeta位点多片段整合方式，三基因片段整合阳性率由1.5%提高到55%左右。
针对DMD和β-amyrin不能完全转化的问题，对产CK工程菌YL-CK0、产齐墩果酸的工程菌YL-OA7和原始菌株ATCC201249胞内代谢物变化进行系统分析。当共表达P450及其还原酶ATR1时，胞内十六碳烯酸（C16：1）与十六碳烷酸（C16：0）相对含量大幅提高，说明可能由于脂肪酸代谢过程的P450酶系竞争ATR1传递的电子，因而PPDS和CYP716A12的活性不能完全发挥，导致前体DMD和β-amyrin不能完全转化。考虑到代谢途径影响决定性因素在基因层面，因此，采用RNA-Seq技术对转录组进行研究，当DMD和β-amyrin积累时，2，3-氧化鲨烯向羊毛甾醇合成途径的多基因表达水平整体提高，导致代谢物流向甾醇合成。综合推测，DMD和β-amyrin未能完全转化的原因在于P450酶所需电子传递过程受到竞争，P450酶活和转化率受限，使该步反应成为限制步骤。
为了提高DMD和β-amyrin转化率，构建并优化了PPDS-ATR1，CYP716A12-ATR1融合蛋白，以提高P450氧化系统电子传递效率。研究了P450和ATR1跨膜区的截除以及两结构域间连接多肽（linker）的长度对P450氧化系统活力的影响。通过优化，在构建的蛋白融合表达工程菌株中，DMD转化率由71%提高到98%以上；β-amyrin转化率由82%提高到接近100%，辅以构建不同来源的HMG1基因的MVA途径优化过程，5L发酵罐中，融合蛋白PPDS-ATR1、CYP716A12-ATR1可以稳定地发挥出高催化活性和转化效率，人参皂苷CK产量达到161.8mg/L，齐墩果酸产量达到540.7mg/L。
通过在解脂耶氏酵母ATCC201249中重构达玛烯二醇（Dammarenediol II，DMD）合成途径，进而将原人参二醇合成所需细胞色素P450单加氧酶PPDS及NADPH-P40还原酶ATR1共表达获得原人参二醇合成菌株；针对三萜合成过程的限速步骤，单基因和多基因水平过表达甲羟戊酸途径（MVA）及下游2，3-氧化鲨烯合成途径基因，在筛选最高原人参二醇产量菌株基础上，引入人参皂苷CK糖基转移酶UGT1后，构建重组菌株YL-CK1，人参皂苷CK摇瓶产量21.7mg/L。
通过引入mixedAS合成酶基因、细胞色素P450单加氧酶CYP716A12及其还原酶ATR1，经前体代谢途径优化，获得齐墩果酸摇瓶产量为48.1mg/L的工程菌株YL-UA/OA；通过引入β-香树脂醇（β-amyrin）合成酶bAS、CYP716A12及ATR1，并将MVA途径多基因组合过表达，经筛选工程菌株YL-OA7的齐墩果酸摇瓶产量为92.1mg/L；构建过程中针对rDNA位点片段整合方式效率偏低的缺陷，提出zeta位点多片段整合方式，三基因片段整合阳性率由1.5%提高到55%左右。
针对DMD和β-amyrin不能完全转化的问题，对产CK工程菌YL-CK0、产齐墩果酸的工程菌YL-OA7和原始菌株ATCC201249胞内代谢物变化进行系统分析。当共表达P450及其还原酶ATR1时，胞内十六碳烯酸（C16：1）与十六碳烷酸（C16：0）相对含量大幅提高，说明可能由于脂肪酸代谢过程的P450酶系竞争ATR1传递的电子，因而PPDS和CYP716A12的活性不能完全发挥，导致前体DMD和β-amyrin不能完全转化。考虑到代谢途径影响决定性因素在基因层面，因此，采用RNA-Seq技术对转录组进行研究，当DMD和β-amyrin积累时，2，3-氧化鲨烯向羊毛甾醇合成途径的多基因表达水平整体提高，导致代谢物流向甾醇合成。综合推测，DMD和β-amyrin未能完全转化的原因在于P450酶所需电子传递过程受到竞争，P450酶活和转化率受限，使该步反应成为限制步骤。
为了提高DMD和β-amyrin转化率，构建并优化了PPDS-ATR1，CYP716A12-ATR1融合蛋白，以提高P450氧化系统电子传递效率。研究了P450和ATR1跨膜区的截除以及两结构域间连接多肽（linker）的长度对P450氧化系统活力的影响。通过优化，在构建的蛋白融合表达工程菌株中，DMD转化率由71%提高到98%以上；β-amyrin转化率由82%提高到接近100%，辅以构建不同来源的HMG1基因的MVA途径优化过程，5L发酵罐中，融合蛋白PPDS-ATR1、CYP716A12-ATR1可以稳定地发挥出高催化活性和转化效率，人参皂苷CK产量达到161.8mg/L，齐墩果酸产量达到540.7mg/L。