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1.研究背景抑制或减轻中风急性期半暗带细胞凋亡或死亡,避免梗死灶扩大,是公认的较为理想的缺血性中风脑保护策略。课题组自主研制的抗中风药物——梓葛冻干粉针(由地黄药效成分梓醇和葛根药效成分葛根素组成),在永久缺血性脑中风模型大鼠和小鼠的非急性期,以及缺血再灌注损伤的脑中风模型大鼠中,均表现出较好的脑保护作用。然而,梓葛冻干粉针对永久缺血性脑中风模型大鼠急性期的脑保护作用尚未观察,其对脑缺血半暗带中神经血管单元细胞的整体保护作用及其可能的通路机制有待研究。本研究获得了国家自然科学基金面上项目(81473549)、教育部博士学科点专项基金项目(博导类:20110182110012)、教育部中央高校基本科研业务费项目(XDJK2014D023)以及重庆市卫生局中医药科研重大项目(渝中医2010[60]2010-1-4)的支持。2.研究目的研究梓葛冻干粉针对永久缺血性脑中风模型大鼠急性期的脑保护作用,以及对脑缺血半暗带中神经血管单元的整体保护作用和机制,为将梓葛冻干粉针开发成治疗缺血性脑中风的候选药物提供基础研究数据。3.方法与结果3.1梓葛冻干粉针对大鼠急性脑缺血损伤整体保护作用研究方法用线栓法梗塞大脑中动脉,复制大鼠中风模型。在造模大鼠苏醒2 h后,采用改良神经功能缺损评分法(m NSS)进行评分并分组。以m NSS评分得4分及以上且各项均有缺损为标准,判定造模成功。将造模成功的64只大鼠随机分为4个组,每组16只:模型组,梓葛冻干粉针65.4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1组。另设假手术组16只。尾静脉注射梓葛冻干粉针或生理盐水,一天2次,给药1天。造模24 h后:(1)用m NSS评分法再次评价大鼠的神经功能,并分析组间差异显著性。(2)每组取8只大鼠麻醉处死,分离新鲜大脑用脑模切片,作TTC染色,拍照后,用软件测算脑梗死面积百分比,并分析比较组间差异显著性。(3)每组另取8只大鼠麻醉,灌流固定后分离大脑,冰冻切片后作HE染色,用显微镜观察并拍照,比较组间脑缺血半暗带组织的损伤情况。结果与假手术组相比,模型组大鼠m NSS得分和脑梗死面积百分比均显著增加(p<0.01),缺血区脑组织大面积坏死,部分区皮质域呈高度疏松筛网状结构,细胞结构不清,红色坏死神经元显著增加。与模型组相比,梓葛冻干粉针65.4mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1组大鼠m NSS得分和脑梗死面积百分比均显著下降(p<0.01、p<0.05),缺血区脑组织坏死程度显著减轻,红色坏死神经元显著减少。3.2梓葛冻干粉针抗大鼠急性脑缺血损伤半暗带保护机制研究方法造模及分组给药方法同第一章,每组12只大鼠。造模24 h后:(1)每组取6只大鼠,按第一章方法制作大脑冰冻切片,用TUNEL+特异性蛋白双重免疫荧光染色标记脑片,荧光显微镜观察缺血半暗带大脑皮质区神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞生长形态并拍照,用软件分析3种细胞的凋亡率,并比较组间差异显著性。(2)另取脑片,用免疫组化技术分别标记Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白,用显微镜观察缺血半暗带大脑皮质区并拍照。(3)每组另取6只大鼠麻醉取脑,提取缺血半暗带大脑皮质组织匀浆蛋白,用WB检测匀浆蛋白中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表达,并分析比较组间差异显著性。结果与假手术组相比,模型组大鼠缺血半暗带大脑皮质层区域神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞的凋亡率显著增加(p<0.01),细胞生长形态严重受损,促细胞凋亡的Bax、Caspase-3、Cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表达均显著增加(p<0.01),抑制细胞凋亡的Bcl-2蛋白表达显著减少(p<0.01)。与模型组相比,梓葛冻干粉针65.4 mg·kg-1、32.7 mg·kg-1和16.4 mg·kg-1组大鼠缺血半暗带大脑皮质区域该3种细胞的凋亡率均显著降低(p<0.01),其生长形态明显改善,上述促调蛋白表达均显著减少(p<0.01,p<0.05);其中,梓葛冻干粉针65.4 mg·kg-1组大鼠Bcl-2蛋白表达显著增加(p<0.01)。3.3体外脑神经血管单元半暗带损伤模型的建立及梓葛冻干粉针的整体保护作用研究方法(1)大鼠大脑皮层神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞的原代培养,以及由该3种细胞共培养组成的脑神经血管单元模型的构建,均参照课题组前期方法。(2)用文献报道的半暗带条件培养液,对所建立的脑神经血管单元模型进行损伤,24 h后,以细胞生长状态、数量、轴突长度和细胞跨内皮电阻值显著(p<0.05)低于正常培养孔为标准,判定体外脑神经血管单元半暗带损伤模型构建成功。(3)将构建的脑神经血管单元模型随机分为5个组,每组6个孔:正常培养组、损伤模型组(半暗带条件培养液损伤24 h)、梓葛冻干粉针3个剂量组(于更换半暗带条件培养液时加入49.0μg·m L-1、24.5μg·m L-1以及12.25μg·m L-1的梓葛冻干粉针)。用药24 h后,用显微镜观察3种细胞的生长形态并拍照,用台盼蓝计数法检测星形胶质细胞和微血管内皮细胞的活细胞数量,用图像分析软件测量神经元轴突长度,用细胞电阻仪检测模型中跨内皮电阻值,并分析比较组间差异显著性。结果(1)成功分离培养出高纯度的大鼠大脑皮层3种原代细胞,构建了由该3种细胞共培养的脑神经血管单元整体模型。与单细胞培养相比,共培养模型中神经元胞体圆润且立体感强,轴突更粗大且长并形成致密网络;脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞间接触更紧密,形成致密的单层;脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞活细胞数量、神经元轴突长度以及模型跨内皮电阻值均显著增加(p<0.05,p<0.01)。(2)与正常培养组相比,经半暗带条件培养液损伤的脑神经血管单元整体模型组中,神经元立体感较差,胞体和轴突变小,轴突网络密度降低;脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体收缩,部分细胞出现脱落;脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞活细胞数量、神经元轴突长度以及跨内皮电阻值均显著降低(p<0.01)。与半暗带条件培养液损伤的脑神经血管单元整体模型组相比,梓葛冻干粉针49.0μg·m L-1、24.5μg·m L-1以及12.25μg·m L-1组脑神经血管单元整体模型中,神经元胞体无明显收缩,突触网络仍较紧密;微血管内皮细胞和星形胶质细胞胞体轻微收缩,胞间接触仍较紧密;脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞活细胞数量、脑神经血管单元整体跨内皮电阻值均显著增加(p<0.01);其中,梓葛冻干粉针49.0μg·m L-1和24.5μg·m L-1组神经元轴突长度显著增加(p<0.01)。3.4梓葛冻干粉针抗体外脑神经血管单元模型半暗带损伤的机制研究方法(1)大鼠大脑皮层3种原代细胞的培养、脑神经血管单元模型的构建及体外脑神经血管单元模型半暗带损伤方法同第3章。(2)将构建的脑神经血管单元模型随机分为7个组,每组6孔:正常培养组:在正常培养条件下培养;损伤模型组:半暗带条件培养液损伤24 h;梓葛冻干粉针3个剂量组:在更换半暗带条件培养液时添加梓葛冻干粉针,使其终浓度分别为49.0μg·m L-1、24.5μg·m L-1、12.25μg·mm L-1;抑制剂MG132组:在更换半暗带条件培养液时添加MG132,使其终浓度为10μM;49.0μg·mm L-1梓葛冻干粉针+MG132组:在更换半暗带条件培养液时,添加梓葛冻干粉针(49.0μg·m L-1)和MG132(10μM)。(3)用药后,用流式细胞仪检测不同组别脑神经血管单元细胞共培养模型中3种细胞凋亡率,并分析比较组间差异显著性。(4)用试剂盒提取不同组别脑神经血管单元模型细胞总蛋白,蛋白定量后,按WB操作步骤,检测分析Bax、Bcl-2、Caspase3、Cleaved caspase-3、Caspase-9、Cleaved caspase-9、Cyt-C、XIAP的蛋白表达,并分析比较组间差异显著性。结果与正常培养组相比,经半暗带条件培养液损伤的脑神经血管单元模型组中,神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞凋亡率均显著增加(p<0.01),细胞Bax、Cyt-C、Cleaved caspase-9、Caspase-3和Cleaved caspase-3蛋白表达均显著增加(p<0.01),Bcl-2和XIAP蛋白表达显著降低(p<0.01)。与半暗带条件培养液损伤的脑神经血管单元整体模型组相比,梓葛冻干粉针49.0μg.m L-1及24.50μg.m L-1组该3种细胞的凋亡率均显著降低(p<0.01),Cyt-C、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3的蛋白表达均显著降低(p<0.01),Bcl-2和XIAP的蛋白表达均显著升高(p<0.01),其中梓葛冻干粉针49.0μg·m L-1组Bax蛋白表达显著降低(p<0.01)。与梓葛冻干粉针49.0μg·m L-1组相比,MG132+梓葛冻干粉针49.0μg·m L-1组XIAP蛋白与Cleaved caspase-3蛋白表达均显著增加(p<0.01,p<0.05)。4.研究结论4.1梓葛冻干粉针能减轻大鼠脑缺血区域受损细胞形态变化,减少细胞死亡,减少缺血区脑组织梗死灶面积,改善大鼠神经功能,对大鼠急性脑缺血损伤发挥整体保护作用。4.2梓葛冻干粉针对大鼠急性脑缺血损伤的整体保护作用,主要是通过抑制缺血半暗带区神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞凋亡实现的,其机制与调节线粒体凋亡通路有关。4.3梓葛冻干粉针对急性脑缺血半暗带神经血管单元细胞线粒体凋亡通路的调节作用,与促进XIAP蛋白表达有关。4.4本研究中,体外脑神经血管单元半暗带模型损伤变化及梓葛冻干粉针的逆转作用,与在体实验结果具有较高一致性。提示该模型可用于缺血半暗带脑神经血管单元细胞损伤机制研究及其保护药物效果的体外评价。