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胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell,ESC）是一种可以在培养过程中保持自我更新并无限增殖,同时保留多向分化潜能的细胞类型。ESC可以区分为以小鼠ESC（mouse ESC,m ESC）为代表的初始态（Na（?）ve）和以人ESC（human ESC,h ESC）为代表的始发态（Primed）两种多能性状态。Na（?）ve多能性具有全面的分化能力和生殖系嵌合潜力,而Primed多能性的分化能力和嵌合贡献潜力却有限。目前为止,除小鼠和大鼠外,其他物种仍未成功建立出具有生殖系嵌合能力的Na（?）ve状态ESC。而猪作为一种生理结构和免疫特性与人十分相似的大动物模型,猪ESC的建立对人类遗传疾病模型及人类异种器官移植供体创建研究具有重大意义。自1990年以来,猪ESC（porcine ESC,p ESC）的研究取得了很大的进展,但是至今都没有可以实现生殖系嵌合的猪多能干细胞（porcine Pluripotent Stem Cell,p PSC）。此外,在ESC的研究上猪还面临着Na（?）ve状态对应的猪早期胚胎发育时期不明确、多能性调控机制不明确以及多能性标记基因不确定且评估标准不明确等关键问题。ESC的多能性来源于胚胎,但经体外培养后,其多能性维持和调控网络发生了一定变化,比如m ESC更类似于植入前上胚层（Pre-Epiblast,Pre-EPI）,而非内细胞团（Inner Cell Mass,ICM）,因此在猪早期胚胎中寻找可能具有Na（?）ve状态的胚胎细胞,对于猪多能性细胞系的鉴定和多能性状态的理解具有重要意义。研究表明小鼠胚胎Pre-EPI细胞与小鼠Na（?）ve状态的ESCs之间具有最大的相似性。据此,本研究首先对小鼠和人的Na（?）ve与Primed两种多能性状态的ESC与各自早期各时期胚胎细胞转录组数据进行比较,验证Na（?）ve状态的细胞与Pre-EPI细胞的相似性。然后对猪不同发育阶段的早期胚胎单细胞转录组数据进行分析,通过与小鼠和人早期胚胎转录组数据分析结果进行比对,初步明确猪早期胚胎的Pre-EP对应的具体发育阶段。在此基础上,对猪Pre-EPI中富集的信号通路进行分析,同时对比分析多能性相关信号通路关键基因在猪胚胎不同发育阶段中的表达模式,进一步明确猪Pre-EPI信号通路调控特点。对实验室已有的各建系体系获得的猪胚胎来源干细胞系,p PSC（KOFL）、p LCDM和猪扩展多能干细胞（porcine Expanded Pluripotent Stem Cell,p EPSC）的多能性和转录组进行比较分析,确定适合筛选猪Na（?）ve多能性干细胞建系体系的工具细胞,进而依据猪Pre-EPI的信号通路特点对关键信号通路的调节因子进行筛选,尝试获得猪Na（?）ve多能性干细胞建系体系。主要研究结果如下:（1）对小鼠和人Na（?）ve和Primed多能性干细胞及小鼠和人早期胚胎转录组数据分析发现,小鼠Na（?）ve状态PSC与E4.5 Pre-EPI具有最高的相似性,小鼠Primed状态PSC与E5.5 EPI具有最高的相似性;而人Na（?）ve状态PSC相较于ICM与植入前晚期囊胚的EPI相似度更高。（2）对鼠和猪原肠胚前各阶段的多能细胞的同源基因进行主成分分析（principal component analysis,PCA）,结果显示小鼠和猪的多能性匹配阶段具有广泛的发育一致性,且猪E7-8 EPI对应于小鼠E4.5 Pre-EPI;因此在本研究中将猪E7-8 EPI称为猪Pre-EPI。对猪各时期胚胎细胞的X染色体活性、代谢方式及多能性标记基因表达分析发现,猪E7-8Pre-EPI中,X染色体处于双激活状态,且同时具有糖酵解和氧化磷酸化两种代谢方式,比对小鼠和人ESC研究结果可以进一步认定猪E7-8 Pre-EPI具有Na（?）ve多能性状态的特征。（3）对多能性标记基因在猪各时期胚胎细胞中的表达模式分析发现,SOX15在猪早期胚胎的多能细胞中表达且在E7-8 Pre-EPI中特异性高表达,因此SOX15可作为猪Na（?）ve多能性状态标记基因的候选基因。（4）对猪Pre-EPI中富集的信号通路分析,发现多能性相关的信号通路和Hedgehog信号通路在E7-8 Pre-EPI中富集,进一步比对分析多能性相关信号通路关键基因在猪胚胎不同发育阶段中的表达模式,发现E7-8 Pre-EPI中PI3K、Activin/Nodal、Hedgehog信号通路相关因子表达上调同时伴随着BMP、AMPK、WNT信号通路相关因子和MAPK信号通路中RAS/RAF的表达下调。（5）对实验室已有的各建系体系获得的猪胚胎来源干细胞系的多能性和转录组进行比较分析,p EPSC高表达Primed多能性状态标记基因,各胚层的标记基因低水平表达,在体外可高效地自发分化为外/中/内胚层细胞,没有明显的分化偏向性。由此,具有稳定的多能性特征和广泛的发育潜能的p EPSC被选为筛选猪Na（?）ve多能性干细胞建系体系的工具细胞。（6）依据猪E7-8 Pre-EPI的信号通路特点,对关键信号通路的调节因子进行筛选,通过检测各实验组的AP阳性率、倍增时间、猪已知的Na（?）ve多能性和E7-8 Pre-EPI标记基因的表达确立了含PI3K、Activin/Nodal、Hedgehog激活剂和AMPK、BMP、RAF、WNT抑制剂的LASI+3i体系。（7）LASI+3i培养体系体外培养p EPSC、pg Epi SC和猪体外受精（In Vitro Fertilization,IVF）囊胚后发现,该体系可提高两种p PSC多能性标记基因SOX2、REX1、ESRRB和已知的猪E7-8 Pre-EPI标记基因SOX15、PRDM14、NODAL、PRDM14、TFCP2L1的表达;也可显著提高囊胚中ICM和Pre-EPI细胞数。（8）为了使体系更有利于从头建系,进一步优化了LASI+3i体系,添加了促进细胞自我更新的CHIR99021得到LASI+4i培养体系,并利用D8 IVF囊胚在LCMSB59体系下衍生outgrowth,在outgrowth传代时将细胞转入LASI+4i体系,获得了LCMS-LASI4i细胞系,该细胞系具有m ESC样的隆起状克隆形态,相较于p EPSC和p LCDM显著提高了核心转录因子SOX2、KLF4和猪E7-8 Pre-EPI标记基因SOX15的表达量,体外可以自发分化为外/中/内胚层和滋养层谱系细胞,具有较广泛的分化潜能。综上,我们得出以下结论:（1）猪E7-8 EPI对应于Na（?）ve状态的Pre-EPI;（2）SOX15在E7-8 Pre-EPI中特异性高表达,可作为猪Na（?）ve多能性状态标记基因的候选基因;（3）p EPSC具有Primed状态PSC特征;（4）以猪E7-8 Pre-EPI信号通路特征为依据,筛选确立的含PI3K、Activin/Nodal、Hedgehog激活剂和AMPK、BMP、RAF、WNT抑制剂的LASI+3i体系可以提高p EPSC和pg Epi SC中猪已知的Na（?）ve多能性和E7-8 Pre-EPI标记基因的表达,也可显著提高猪IVF囊胚中ICM和Pre-EPI细胞数;（5）LASI+3i添加CHIR99021后获得的LASI+4i培养体系利用IVF胚胎在该体系中建立了LCMS-LASI4i细胞系,具有较高水平核心转录因子和猪E7-8 Pre-EPI标记基因的表达,在体外具有三胚层分化能力,同时也具有滋养层谱系的分化能力。