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前言 亚甲蓝(Methylene Blue)简称MB，是噻嗪类染料化合物，为水溶性色素，具有一定的神经阻滞作用。对SK-N-MC和U-373MG胶质瘤细胞代谢研究时发现MB可直接杀伤及抑制其在体外的生长，对人肺癌细胞(LTEP-23)的研究也证实了体外杀伤作用。 肿瘤的发生与细胞凋亡异常有关。细胞凋亡在很大程度上依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl asparate-specifin protease，Caspase)家族的激活。其中Caspase-3是哺乳动物凋亡中的关键酶，尚未见亚甲蓝诱导C6细胞凋亡其对Caspase-3 mRNA水平影响的报道。 我们通过流式细胞仪检测C6细胞的凋亡率；通过RT-PCR进行凋亡相关基因Caspase-3 mRNA水平的检测，证实MB的抗胶质瘤的作用，并为MB作为肿瘤辅助治疗提供理论和实验依据。 实验材料和方法 1．实验材料 C6胶质瘤细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。 2．实验试剂 RPMI-1640和10％小牛血清购自美国GIBCOLBRL公司； 胰蛋白酶购自美国Sigma公司； Caspase-3引物购自华美公司； 100bp DNA Ladder购自华美公司； RNA提取试剂为美国GIBCOLBRL公司的TRIzol reagent； PCR Kit购自宝生物工程(大连)有限公司 反转录系统系日本宝生物(大连)公司的BcaBest Kit。 3．实验方法 (1) 流式细胞术进行细胞周期解析。 (2) 用RT-PCR进行凋亡相关基因mRNA检测。实验结果.经流式细胞术检测，0.1林岁而MB作用24小时后出现典型的凋亡峰。2.经RT一PCR检测证实，Caspase一3 mRNA随MB作用时间延长而升高，随MB作用浓度增高而升高，各组间均有显著差异(P<0.01)。讨论 MB具有良好的渗透染色性，对肿瘤细胞的亲和力及渗透力与正常细胞有所不同，可使肿瘤细胞蓝染，而正常粘膜上皮不被着色，实验结果表明:MB杀伤癌细胞有明显的浓度和时间依赖性。 现代观点认为，肿瘤的发生与细胞凋亡异常有关。本实验经流式细胞术证实MB对C6胶质瘤细胞有促凋亡作用。 细胞凋亡是一种多基因调控下的程序性细胞死亡，半胧氨酸蛋白酶在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。其中Caspase一3是哺乳动物凋亡中的关键酶。正常情况下，以无活性酶原形式存在。在蛋白酶级联切割过程中，Caspase一3处于核心位置，不同的蛋白酶分别切割Caspase一3酶原，从而激活Caspase一3;活化的Caspase一3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，使细胞死亡。此外文献报道，CasPase一3还通过破坏细胞抗凋亡因素(如bel一2)，破坏细胞的结构(如结构蛋白aetin、fodrin、larnin)在细胞凋亡中发挥作用。 本实验中以0.1林扩nil MB处理O、6、12、24小时的C6细胞，以O此/耐、0.05协岁rul，0.1卜岁d，0.15林g/rnl MB处理24小时C6细胞，Caspase一3mRNA随MB作用时间延长和浓度增加而升高，各组间均有显著差异(P<0.01)。提示MB可能通过Caspase一3途径诱导C6细胞凋亡，且MB诱导C6细胞凋亡中Caspase一3 mRNA的表达与时间和浓度相一致。结论MB对C6细胞具有诱导凋亡作用，此过程伴有Caspase一3的升高，提示MB可能通过Caspase一3途径诱导C6细胞凋亡。