【摘 要】
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花青素是一种水溶性的天然色素,在多种植物体内存在,具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等特性。花青素的合成受到结构基因、调节基因、小RNA以及外部环境因子等多方面的影响。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类没有蛋白质编码能力的非编码RNA。许多研究表明,lncRNA可以通过co-location(顺式作用)或co-expression(反式作用)的方式对靶基因进行调
【基金项目】
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国家重点研发专项(2018YFD1000705和2018YFD1000700); 山西省自然基金(201801D121238); 山西省重点研发项目(201803D221008-6); 山西省高等学校科技创新项目(2019L0388); 山西省新兴产业领军人才项目
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花青素是一种水溶性的天然色素,在多种植物体内存在,具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤等特性。花青素的合成受到结构基因、调节基因、小RNA以及外部环境因子等多方面的影响。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类没有蛋白质编码能力的非编码RNA。许多研究表明,lncRNA可以通过co-location(顺式作用)或co-expression(反式作用)的方式对靶基因进行调控,从而广泛参与植物的整个生命活动过程。但是目前关于lncRNA参与调控花青素合成方面的研究报道却寥寥无几。本研究通过高通量测序技术挖掘并鉴定出1421个在紫心马铃薯(‘希森8号’)和黄心马铃薯(‘晋16’)块茎中差异表达的lncRNA。我们筛选到了参与马铃薯块茎花青素合成相关的lncRNA及其靶基因,进一步从‘希森8号’中克隆到了1个与马铃薯块茎花青素合成相关的lncRNA(LINC4206)及其靶基因StDFR,通过生物信息学和分子生物学手段分析其功能。主要结果如下:1、通过构建6个链特异性cDNA文库并进行高通量测序,共鉴定到了4376个lncRNA,其中差异表达的lncRNA共有1421个,在‘希森8号’中上调表达的有735个,下调表达的有686个。对差异表达lncRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果表明,通过顺式作用调控的靶基因主要富集在磷代谢、水解酶活性等途径;通过反式作用调控的靶基因主要富集在细胞代谢、磷代谢过程以及转移酶活性等途径。KEGG富集结果显示,通过顺式作用调控的靶基因参与次生代谢的生物合成、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和糖异生等生物过程;通过反式作用调控的靶基因主要富集在植物激素信号转导、核苷酸结合、氨基酸代谢和RNA转运等过程。2、基于差异表达的lncRNA及它们所作用的与花青素生物合成相关靶基因之间的相关性构建lncRNA-mRNA互作网络,并对马铃薯花青素合成通路相关lncRNA及其共表达靶基因进行了表达模式分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了这些基因在‘希森8号’和‘晋16’块茎中的表达水平是否与转录组测序结果一致。结果表明,qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。qRT-PCR结果与测序结果的相关性分析显示,两者之间有较高的相关性,证实了测序结果的可靠性。3、利用PCR方法从‘希森8号’中克隆得到1个与花青素合成相关的lncRNA-LINC4206及其靶基因StDFR,其序列长度分别为816 bp和1149 bp,并对靶基因StDFR基因进行了生物信息学分析。结果表明,该基因编码383个氨基酸,相对分子量为42469.78,是一个亲水性稳定蛋白,没有跨膜结构,也没有信号肽。亚细胞定位预测显示StDFR蛋白定位于细胞质和细胞质膜上。StDFR蛋白的二级结构主要由无规则卷曲、α-螺旋组成,所占比例分别为43.98%和36.65%。保守结构域分析表明,该蛋白具有差相异构化结构域(epimerase结构域),是短链脱氢酶/还原酶家族的特征性结构。系统进化树分析表明马铃薯StDFR蛋白与茄子Sm DFR具有较近的亲缘关系。LINC4206与StDFR基因在‘希森8号’和‘晋16’中的表达趋势一致,进一步从m RNA水平证明了StDFR是LINC4206的靶基因,推断LINC4206可能靶向作用于StDFR正调控马铃薯块茎花青素的生物合成。此外,还成功构建了LINC4206和StDFR的过表达载体,为进一步对其进行生物学功能研究奠定基础。以上结果为阐明lncRNA调控马铃薯块茎花青素合成的分子机制提供了参考价值。
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