调更汤有效成分芍药苷调控JNK线粒体信号通路介导原代下丘脑神经元细胞凋亡的机制研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:benxiaohai10000
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目的通过研究芍药苷(Paeoniflorin,PF)对损伤的原代下丘脑神经元细胞的抗凋亡作用,探索“调更汤”有效成分PF对下丘脑神经元细胞的保护作用机制。方法(1)新生雌性SD大鼠下丘脑神经元体外培养及神经元鉴定:采用胰酶消化法制备下丘脑单细胞悬液,倒置相差显微镜进行形态学特点观察;胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及β-tubulinⅢ标记,免疫细胞化学染色法鉴定神经元细胞;(2)CCK-8及流式细胞术筛选三丁基氯化锡(tributyltin chloride,TBTC)造模浓度和时间:不同浓度TBTC(100~300μg/L)处理培养7d的下丘脑神经元细胞,分别干预24h、48h后,CCK-8法检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡,确定TBTC损伤下丘脑神经元细胞凋亡模型造模时间及浓度。(3)PF改善下丘脑神经元细胞损伤情况:CCK-8法筛选芍药苷最佳作用浓度及时间;选用17β-estradiol作为阳性对照,将下丘脑神经元细胞分成6组:对照组、TBTC组、17β-estradiol+TBTC组、PF低剂量+TBTC组、PF中剂量+TBTC组、PF高剂量+TBTC组分别干预,以CCK-8法、乳酸脱氢酶法、Hoechst 33258免疫细胞染色法、流式细胞术、JC-1线粒体膜电位检测分析PF预处理对神经元凋亡情况的影响并计算凋亡百分率。(4)PF对损伤的原代下丘脑神经元细胞发挥神经保护作用的机制:RT-PCR检测抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax的表达;Western blot检测MKK4、p-MKK4、JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白水平的表达。结果:(1)本研究培养的新生雌性大鼠原代下丘脑神经元细胞生长状态良好,纯度为92.23%。(2)下丘脑神经元细胞对不同浓度的TBTC处理呈剂量依赖性生长抑制;流式细胞仪检测显示150μg/L TBTC干预24小时下丘脑神经元细胞的凋亡率为:(42.6±6.6)%(P<0.01),最适合模拟下丘脑神经元细胞凋亡模型。(3)PF(25、50、100μM)预处理后,以TBTC干预,发现17βestradiol组和PF(25、50、100μM)各组24h和48h细胞活力显著升高,分别为17β-estradiol组:(85±8.3)%、(75±8.2)%(P<0.01)、PF 25μM组:(71±13.9)%、(62±13.7)%(P<0.05)、PF 50μM组:(79±10.0)%、(69±10.2)%(P<0.01)、PF 100μM组:(88±10.2)%、(78±10.1)%(P<0.01),且PF预处理各组中乳酸脱氢酶活性显著减低(P<0.01);Hoechst 33258免疫细胞染色法结果显示17β-estradiol组和PF各剂量组固缩形态和颗粒细胞显著减少,且呈浓度-剂量相关性(P<0.01);流式细胞术结果显示表明TBTC处理24 h后细胞凋亡明显增加至(42.9±2.5)%,(与对照组相比P<0.01),50μM、100μM PF预处理和17β-estradiol处理后显著降低细胞凋亡比率至(33.8±2.7)%、(21.54±2.9)%、(23.6±3.2)%(P<0.01);JC-1线粒体膜电位检测结果表明,17β-estradiol组和芍药苷25,50或100μM各组预处理可以抑制线粒体膜电位的下降(P<0.01)。(4)TBTC干预后,磷酸化的MKK4和JNK蛋白表达上升,p-JNK/JNK表达水平升高(P<0.05);芍药苷预处理后,磷酸化的MKK4及JNK蛋白表达下降,p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK表达水平降低(P<0.05),下调剪切的caspase-3水平(P<0.01),提高Bcl-2m RNA水平,降低Bax m RNA水平,降低Bcl-2/Bax基因及蛋白比例(P<0.05)。加入JNK特异性激动剂后,PF仍能降低p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK表达水平(P<0.05)。结论:(1)TBTC浓度150μg/L、干预24h可作为诱导下丘脑神经元细胞凋亡的模型。(2)PF(25、50、100μM)预处理均可以改善TBTC诱导的下丘脑神经元细胞凋亡,表明PF对下丘脑神经元细胞凋亡具有抑制作用。(3)PF预处理可以通过调节MKK4-JNK介导的线粒体信号途径对TBTC损伤的下丘脑神经元细胞发挥神经保护作用,抑制MKK4及JNK的磷酸化以降低下丘脑神经元细胞凋亡。
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