研究背景心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）后的心力衰竭仍然是世界范围内的一个重大公共卫生问题。心肌重构在心肌梗死后心力衰竭发生发展过程中起到重要作用,是不良预后的重要原因。心肌纤维化是心肌梗死后心肌重构的一个常见过程,以心肌间质成纤维细胞增殖、胶原过度沉积,及胶原异常分布为特征的心肌间质重构为主要病理表现,导致心肌的顺应性降低,并最终进展为心力衰竭。然而,心肌梗死后心肌纤维化的细胞与分子机制尚未阐明,临床上也缺乏特别有效的治疗药物与干预手段。目前,心肌纤维化的具体发病机制并不十分明确,一般认为多与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）、细胞凋亡、调控性细胞因子、氧化应激、炎性因子等存在密切关系,这些因素通过相同或者不同的信号传导通路影响着心肌纤维化的发展进程。目前将抑制或逆转心肌纤维化,确定相关治疗靶点的研究工作已经成为一项重要的课题。因此,寻找抑制心室重构的药物已经成为防治心衰心肌纤维化的重要研究目标之一。临床上阻断或逆转心肌纤维化的治疗方案可选择性很少,沙库巴曲缬沙坦作为一种新型的血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂（angiotensin-receptor-neprilysin inhibitor,ARNI）类药物,主要由沙库巴曲和缬沙坦按1:1的比例制成的钠盐复合性药物,ARNI除了阻断血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）信号外,还通过脑啡肽酶抑制利钠肽的分解来增强利钠肽。脑啡肽酶是一种降解多种血管活性肽的内肽酶,通过阻滞血管紧张素Ⅱ受体和抑制脑啡肽酶,进而达到舒张血管,逆转和预防心肌重构,以及促尿钠排泄等功效。钠尿肽系统的激活通过促进血管舒张、利尿、抑制纤维化和肥大来抵消RAAS系统效应。数据表明ARNI可以改善心功能和重塑,然而ARNI在心肌梗死（MI）后纤维化和重构背景下的心脏保护作用机制尚不清楚。有研究证实ARNI逆转心肌重塑是通过直接抑制成纤维细胞的活化和病理纤维化的发展来实现的。在心肌纤维化参与心脏重构过程中,已经证实有多种信号通路的参与,Wnt/β-catenin是一种进化保守的信号通路,对胚胎发育、组织稳态和组织损伤修复至关重要,在成人心脏组织中相对沉默,但在各种心脏损伤后如心肌梗死,从急性缺血性损伤到慢性压力过载,Wnt/β-catenin信号会重新激活,继而引起β-catenin在细胞质中积聚,并易位入核,启动促纤维化因子的表达。Wnt/β-catenin信号被证明可促进心脏纤维化,诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化,促进胶原生成,在调节心肌纤维化中起主导作用。研究证实MI后抑制Wnt/β-catenin信号可以改善梗死愈合面积和预防心力衰竭,这表明阻断Wnt/β-catenin信号通路可能是预防心肌梗死后不良心脏重构的潜在治疗方法,可有效减缓心肌纤维化,进而减缓心肌重构和改善心脏功能。可溶性卷曲相关蛋白（soluble frizzled related protein1,sFRP-1）是一种分泌的卷曲相关蛋白,是Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂,sFRP-1阻止Wnt配体与质膜上的frizzled受体结合后,导致β-catenin水平显著下降,提示sFRP-1主要是抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活。sFRP-1基因过表达抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化能显著抑制心肌纤维化,减缓心肌重构及改善心脏功能。基于上述研究背景,本课题组拟通过构建心肌梗死小鼠模型,探究ARNI在改善心肌梗死后心肌重构及心功能障碍中的作用及分子机制,提出研究假说,ARNI通过调节sFRP-1的表达抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而降低胶原蛋白分泌与沉积,抑制纤维化分子的表达,改善心肌梗死后心肌纤维化,为ARNI改善梗死后心肌纤维化作用提供新的理论支持及实验依据。通过体内和体外实验,评估了 ARNI在心肌梗死背景下的作用和机制,探究ARNI对Wnt/β-catenin信号通路的潜在作用是通过sFRP-1发挥抑制作用的。研究目的1.构建小鼠心肌梗死模型,探究沙库巴曲缬沙坦和缬沙坦对小鼠心肌梗死后心功能障碍及心肌纤维化的作用。2.探究沙库巴曲缬沙坦和缬沙坦是否通过Wnt/β-catenin信号通路改善心肌纤维化及细胞凋亡,发挥心脏保护作用。3.体外实验利用sFRP-1抑制剂Way316606进一步探究ARNI是否通过sFRP-1调控Wnt/β-catenin信号通路。研究方法1.动物模型构建及分组取雄性8周龄C57BL/6雄性小鼠120只,采用左冠状动脉结扎术造小鼠心肌梗死模型,分为假手术（Sham）组、心肌梗死（MI）组、沙库巴曲缬沙坦（ARNI）组和缬沙坦（VAL）组。2.心脏超声采用Vevo770小动物心脏超声系统进行小鼠心脏超声检测,收集左室舒张末期直径（Left ventricular end diastolic diameter,LVED d）、左心室心肌质量（Myocardial mass of the left ventricle,LV mass）等,左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室缩短分数（fractional shortening,FS）,取心尖四腔心切面,截取脉冲多普勒图像,计算舒张早期二尖瓣血流速度峰值（E）和舒张晚期二尖瓣血流速度峰值（A）的比值E/A;在组织多普勒显像下,计算舒张早期二尖瓣半环速度峰值（E’）和舒张晚期二尖瓣半环速度峰值（A’）的比值E’/A’,评价小鼠心脏功能。3.动物取材使用0.8%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠,麻醉理想后,测量并记录小鼠体重。经心尖取血并进行全身灌注,后剪下心脏,计划行分子生物学检测的心脏组织保存于组织冻存管,并投放于液氮中。计划行组织病理学检测的心脏组织固定于含4%甲醛的PBS溶液中,常温保存。4.血清学检测采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）-小鼠NT-proBNP ELISA试剂盒,测定小鼠NT-proBNP的浓度。5.TTC染色法小鼠心脏用生理盐水冲洗并放置于-20℃冰冻30分钟后取出,然后将其横切成约2 mm薄片,使用TTC染色,评估小鼠心肌梗死面积。6.组织学染色动物组织取材,称取小鼠体重及心脏质量等值,测量心脏大小,留取心脏组织大体图像。将小鼠心脏组织心室乳头肌水平冠状面取3-5 mm进行4%甲醛组织固定液固定处理;固定48-72小时后石蜡包埋并切片,经脱蜡等处理后进行HE、Masson、天狼猩红、免疫组化、免疫荧光染色、TUNEL凋亡等组织学染色。7.乳鼠成纤维细胞的提取及培养取1-3天新生小鼠乳鼠提取心肌成纤维细胞,于六孔板高糖DMEM培养基中培养,并按照实验计划分组。8.实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应（reverse transcription-polymerase chain reaction RT-PCR）检测提取心肌组织及成纤维细胞RNA提取,行实时定量RT-PCR检测β-catenin、sFRP-1、GSK-3β、Dvl-1、α-SMA、TGF-β、ANP、BNP 的 mRNA 表达。9.Western blot 检测提取心肌组织及成纤维细胞蛋白,蛋白印迹实验检测β-catenin、活化β-catenin、sFRP-1、糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、胶原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ,Coll Ⅲ）及转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）的表达。10.数据分析数据都以平均值±标准误（Mean±SEM）表示,使用GraphPad Prism 7.0软件进行数据分析,两组间比较采用t检验,大于两组间比较数据采用多因素方差分析（ANOVA）后再进行post-hoc分析,以P＜0.05判定为组间具有统计学差异。研究结果1.沙库巴曲缬沙坦改善心肌梗死后心肌重构及心功能障碍组织学染色提示接受药物治疗后的心肌梗死小鼠,尤其是沙库巴曲缬沙坦组,小鼠的左心室容积和横截面积明显减小。超声心动图及NT-proBNP血清学结果提示沙库巴曲缬沙坦改善心肌梗死心功能障碍效果明显于缬沙坦。2.沙库巴曲缬沙坦改善心肌梗死后心肌纤维化心肌组织Masson和天狼猩红染色结果示,MI组梗死区及周围区域明显纤维化,VAL组心肌纤维化程度有降低,但ARNI组较VAL组更明显。同时,MI组小鼠心肌组织的α-SMA、TGF-β、胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达增加,药物干预后,上述分子表达呈下降趋势,ARNI组比VAL组更明显。3.沙库巴曲缬沙坦改善心肌梗死诱发的细胞凋亡小鼠心肌组织切片行TUNEL染色,结果与对照组相比,心肌梗死（MI）组心肌细胞DNA损伤显著增加,TUNEL阳性细胞比例明显增加,ARNI组和VAL组小鼠心肌组织中心肌细胞DNA损伤降低,TNNEL阳性细胞比例减少,而且ARNI组更显著。4.沙库巴曲缬沙坦可能通过sFRP-1抑制心肌梗死后Wnt/β-catenin信号通路小鼠心肌梗死4周后心肌组织中β-catenin和活化β-catenin的表达增高于假手术组,沙库巴曲缬沙坦干预后,β-catenin和活化β-catenin表达水平下降,并且比缬沙坦显著;Dvl-1的表达趋势和β-catenin相同;GSK-3β的表达趋势与β-catenin相反;为了在体外实验进一步验证ARNI对Wnt/β-catenin信号通路作用,成纤维细胞经过AngⅡ刺激后,β-catenin、dishevelled-1（散乱蛋白-1,Dvl-1）分子表达升高,ARNI抑制成纤维细胞中β-catenin、Dvl-1分子的表达水平并且显著于缬沙坦。上述结果提示,心肌纤维化进程中Wnt/β-catenin信号通路被激活,而沙库巴曲缬沙坦可以抑制Wnt/β-catenin信号通路并且明显于缬沙坦。同时,我们发现小鼠心肌梗死后经过药物治疗后心肌组织中sFRP-1分子表达升高,而且ARNI比缬沙坦更显著,我们认为沙库巴曲缬沙坦抑制心肌梗死后Wnt/β-catenin信号通路的作用可能与sFRP-1有关。5.ARNI通过调控sFRP-1改善细胞胶原沉积及纤维化经AngⅡ刺激的成纤维细胞中的α-SMA和TGF-β的表达水平显著升高于空白对照组,接受ARNI（Lcz696）药物孵育的成纤维细胞中α-SMA和TGF-β的表达水平较AngⅡ刺激组明显降低,ARNI组较VAL组的α-SMA表达水平有显著差异,然而ARNI组和VAL组的TGF-β表达水平没有统计学意义。给与sFRP-1抑制剂Way316606后,成纤维细胞经过ARNI干预后胶原蛋白Ⅲ、α-SMA和TGF-β表达低于AngⅡ刺激组,而抑制剂Way316606组,胶原蛋白Ⅲ、α-SMA和TGF-β表达高于ARNI组。上述结果提示ARNI通过调控sFRP-1的表达抑制心脏成纤维细胞胶原沉积,改善纤维化。6.ARNI通过sFRP-1抑制成纤维细胞Wnt/β-catenin信号通路体内实验我们发现小鼠心肌梗死后给予ARNI干预后sFRP-1表达升高,为了在体外实验中探究ARNI是否对sFRP-1表达的影响,我们发现成纤维细胞经过ARNI或缬沙坦干预后,ARNI干预组sFRP-1表达升高较缬沙坦组显著。为了进一步验证ARNI通过sFRP-1调控Wnt/β-catenin信号通路,体外实验采用sFRP-1抑制剂Way316606,抑制sFRP-1的表达,我们发现ARNI干预组β-catenin蛋白表达明显降低比Ang Ⅱ组,但是加了 sFRP-1抑制剂Way316606后,β-catenin蛋白表达是比ARNI干预组升高的。结果证明ARNI通过sFRP-1抑制成纤维细胞内Wnt/β-catenin信号通路的活化。研究结论1.ARNI可以改善心肌梗死小鼠的心室重构及心功能障碍,而且比缬沙坦有优势。2.ARNI通过抑制Wnt/β-catenin信号通路改善心肌梗死后心肌纤维化。3.ARNI通过sFRP-1抑制Ang Ⅱ刺激的心肌成纤维细胞的Wnt/β-catenin信号通路,抑制心脏成纤维细胞胶原沉积及纤维化。