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棉花是一种重要的纤维和油料作物。棉花杂种优势利用是增产的重要途径。在生产实践中,棉花理想杂交制种方式是三系杂交。培育强优势不育三系杂交种的关键是创制优良的恢复系,因此围绕恢复基因开展相关应用基础研究显得尤为重要。哈克尼西棉细胞质雄性不育（CMS-D2）是棉花主要的细胞质雄性不育之一。然而,CMS-D2恢复基因Rf1至今没有被分离克隆成功,Rf1和CMS-D2胞质的互作机制仍不清楚。本研究利用Pac Bio单分子实时测序技术获得CMS-D2恢复系（R）花药的全长转录本,结合“三系”材料和杂交种（F1）的Illumina RNA测序数据,以及课题前期研究Rf1位于Chr＿D05上,进一步筛选Rf1候选基因,并进行结构分析与初步功能验证。取得的主要研究结果如下:1.共获得44,338个基因位点的107,066个转录本,包括10,086个新基因的转录本和66,419个已知基因的新转录本。共鉴定到56,572个选择性剪接（AS）事件、1,146个lnc RNA、61个融合转录本、10,466个具有可选择性多聚腺苷酸化（APA）位点的基因以及60,995个具有预测开放阅读框（ORF）的新转录本。此外,还有819个Full-length Non-chimeric（FLNC）reads没有被定位到TM-1参考基因组。这些结果为陆地棉基因组注释和转录组研究提供了丰富的数据资源。2.基于不育系（A）、保持系（B）和恢复系（R）花药Illumina RNA测序数据,对所有表达基因进行以下3个比较组分析:A与B、R与B、R与A,分别鉴定到1,295个、1,721个和837个差异表达基因（DEGs）。对DEGs进行GO和KEGG富集分析发现,“binding”是在所有比较组中富集比率最高的GO分类。A与B、R与B比较组中DEGs在“Cutin,suberine and wax biosynthesis”KEGG通路均显著富集;R与A比较组中DEGs在“Circadian rhythm-plant”KEGG通路显著富集。3.筛选在R中特异表达、而在A和B中几乎不表达的DEGs,包括在D05及其同源的A05染色体、Scaffold以及未比对到TM-1参考基因组上的FLNC Reads。对6个可能是恢复基因的候选基因进行荧光定量PCR验证,结果显示Gh CCS772和Gh CCS61在R中的表达量均极显著高于A和B。进一步分析发现,这2个基因在F1中的表达量也显著高于A,且在R中的表达量大约是F1的两倍。此外,在CMS-D2“三系”材料花药以及R不同组织中进行表达模式分析,发现Gh CCS772和Gh CCS61在R不同组织中均特异性高表达,尤其在花药中表达量最高,说明这2个候选基因可能是恢复基因。4.采用RACE技术获得了Gh CCS772和Gh CCS61的全长转录本,然后对其进行初步预测分析。利用病毒诱导基因沉默（VIGS）技术沉默这2个基因,发现阳性植株均呈现出目的基因表达水平降低;除了少数株系沉默效率高以外,总体上其他株系沉默效率较低,这可能是沉默效率不相同所致。花粉活力测定实验发现,大部分阳性株的花粉生活力有所下降,但差异不显著。此外,观察到部分阳性株花药发育出现了花药不开裂等异常表型。说明这2个候选基因可能是潜在的CMS育性恢复基因或与花药发育相关的基因。