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非洲猪瘟 ASF(African swine fever),是由非洲猪瘟病毒 ASFV(African swine fever virus)引起的家猪及野猪高死亡率的一种疾病。ASFV是大型双链DNA病毒,长约180 kb,编码蛋白多达180个。ASFV主要通过接触传播,短距离内也可通过空气传播,感染猪肺泡巨噬细胞引起家猪及野猪急性高热症状。目前,ASFV现已传播至中国大部分省市,造成了巨大的经济损失。迄今为止,尚无有效的ASFV疫苗,重组腺病毒载体疫苗能够诱导坚强的细胞免疫及体液免疫应答,且安全性更高。因此,本研究旨在制备表达多种ASFV保护性抗原的重组腺病毒载体,为研究ASF重组腺病毒载体疫苗提供借鉴。EP153R(EP153R)、CD2v(EP402R)、p54(E183L)和 p72(B646L)蛋白在 ASFV 复制、包装等过程中均具有重要作用,是ASFV重要的保护性抗原。以EGFP为标签蛋白,构建pShuttle-EGFP-EP 1 53R-EP402R、pShuttle-EGFP-EP153R-E183L 和 pShuttle-EGFP-B646L;为提高免疫效果,以CTLA4部分序列为先导序列,构建pShuttle-CTLA4-EP 153R-EP402R、pShuttle-CTLA4-EP153R-E183L 和 pShuttle-CTLA4-B646L,构建完成的载体分别转染 293T 细胞,western blot对融合蛋白表达进行验证(pShuttle-CTLA4-B646L不表达),正确表达的质粒转化到BJ5183大肠杆菌重组菌株中,分别重组为pAd-EGFP/CTLA4-EP 153R-EP402R、pAd-EGFP/CTLA4-EP153R-E183L 和 pAd-EGFP-B646L 重组腺病毒载体,转染 293A 细胞包装重组腺病毒,重组腺病毒皮下注射小鼠进行免疫,一免后7天进行加强免疫,分别于一免后14d、30d、46d采血收集血清,使用原核表达产物EP153R蛋白及EGFP蛋白检测血清中特异性抗体产生水平;一免后50d采集脾脏及腋下、腹股沟淋巴结,使用原核表达蛋白EP153R与EGFP蛋白刺激淋巴细胞,分别检测脾脏及淋巴结细胞增殖水平;同时使用流式细胞仪检测抗原刺激后CD3+细胞中IFN-γ+细胞比例,分析重组腺病毒免疫后小鼠对同种抗原的识别及反应程度。结果表明:成功构建的5种融合表达ASFV保护性抗原的重组腺病毒免疫小鼠后,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且CTLA4为佐剂的重组腺病毒免疫组能引起更好的体液免疫,EP153-CD2v 比EP153R-p54蛋白引起的体液免疫更强,EGFP-p72蛋白引起的体液免疫反应较弱;淋巴细胞增殖实验显示,Ad-EGFP-p72免疫组淋巴细胞经EGFP蛋白刺激后可增殖分化,其余免疫组经EP153R刺激后无明显增殖。流式结果与淋巴细胞增殖实验相符,EGFP蛋白刺激Ad-EGFP-p72免疫组有特异性IFN-y分泌,其余组经EP153R蛋白刺激后无明显变化。