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利用正向遗传学途径,从 XVE系统构建的突变体库中筛选得到拟南芥耐硒突变体 vse1-1,通过Tail-PCR克隆了基因 VSE1,经数据库比对该基因为拟南芥 APX1(At1g07890)基因。本文在此基础上,对 vse1-1突变体在亚硒酸钠胁迫下的响应进行深入研究,阐明 APX1基因调控拟南芥硒耐受及硒积累的分子机理。研究结果如下: 基因表达分析显示,APX1基因在突变体 vse1-1中被敲除。30μM Na2SeO3胁迫条件下,与野生型相比, vse1-1突变体表现出明显的耐硒性状,并有一定的硒积累能力。 构建35S::APX1超表达载体并进行遗传转化,获得APX1过表达和互补的转基因植株,进行APX1基因功能验证。利用农杆菌介导的Floral Dip转化法,将植物表达载体转入拟南芥野生型 WT和突变体 vse1-1中。通过含抗性培养基筛选、鉴定,获得转基因植株。在亚硒酸钠胁迫下,APX1过表达植株 OE1表现的性状与野生型相似;APX1互补植株COM1恢复了野生型的表型。 分析APX1基因敲除型 SAIL等位系vse1-2,vse1-3突变体(购自美国拟南芥种质资源中心)对亚硒酸钠胁迫的响应,结果显示,其表现的性状与vse1-1突变体一致,有一定的硒耐受和硒积累能力。 APX1-eGFP融合蛋白亚细胞的定位显示, APX1基因编码的蛋白主要分布在细胞质中。 抗氧化分析显示,硒盐胁迫下,vse1-1突变体中过氧化氢含量低于WT;抗坏血酸及谷胱甘肽( GSH)含量、过氧化氢酶及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性高于WT,抗坏血酸过氧化物酶活性没有明显变化。这表明,外源硒通过吸收代谢参与谷胱甘肽过氧化物酶的合成,同时胁迫诱导抗氧化剂及抗氧化酶的产生来提高突变体 vse1-1的硒耐受性,即突变体 vse1-1的硒耐受性与抗氧化系统相关。 vse1-1突变体在BSO+Na2SeO3培养下,对硒的耐受性消失,表明突变体vse1-1的硒耐受性依赖于GSH途径。进一步对硒相关基因表达分析显示, Na2SeO3胁迫下 AtGSH1、AtGPX、AtATM3基因在vse1-1突变体中的表达量上调,显著高于野生型,说明 AtGSH1、AtGPX、AtATM3参与了由 APX1基因敲除引起的对亚硒酸钠耐受的应答响应。 转录因子ZAT6可能调控AtGSH1基因表达,为此将vse1-1与ZAT6敲除突变体zat6-1杂交,构建双突变体vse1-1/zat6-1。将进一步分析双突变体vse1-1/zat6-1对亚硒酸钠胁迫的响应,探究突变体 vse1-1的硒耐受性是否与转录因子 ZAT6调控有关。 由此推测,外源硒可能通过活性氧参与细胞信号转导,诱导Zat6基因的表达,进而促进AtGSH1基因的表达,增加体内的GSH含量,螯合过量的硒;同时诱导AtGPX基因的表达,产生GSH-Px,增加硒耐受及硒积累。 以上结果表明,APX1基因可能通过抗氧化途径及GSH途径参与拟南芥亚硒酸钠胁迫耐受的调节。