糖尿病相关性感染性疾病将成为中国乃是整个世界一个棘手的重要的健康问题。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa,P.a）在慢性创面感染和囊性纤维化性肺炎的生物膜（Biofilm,BF）感染中扮演着一个无可替代的角色。环二鸟苷酸（Cyclic diguanosine-5’-monophosphate,c-di-GMP）信号系统以c-di-GMP作为细菌内第二信使控制生物许多方面的行为,包括了P.a BF的形成和分散,尤其是调控胞外多糖复合物（Extracellular polymeric substances,EPS）和作为细菌形成BF中胞外基质组成部分的表面蛋白的产生。既往研究表明,在糖尿病创面感染模型中,有BF感染的创面比没有BF感染的创面愈合时间更长。目前,存在争论比较多的是胰岛素是否改善P.a所致的感染。Watters等人在体外研究中发现胰岛素促进P.a野生株PAO1BF形成这个现象,但并没有从机制上去探讨胰岛素是如何促进野生株PAO1BF的形成。其机制与其c-di-GMP信号通路关系如何,未见有进一步的报道?迄今为止,尚未发现胰岛素对c-di-GMP表达不同的P.a创面感染愈合的影响及其相关机制的研究报道。因此本研究主要目的是探索胰岛素对糖尿病小鼠P.a感染创面愈合的影响,这些影响与细菌细胞内c-di-GMP信号通路调控BF形成与分散的是否相关。为此,我们选择P.a细胞内c-di-GMP表达不同的三个菌株作为我们的实验菌株,它们分别为:对照株PAO1,细胞内c-di-GMP低表达株的PAO1/P_lac-yhjH和细胞内c-di-GMP高表达株的PAO1ΔwspF。体外实验,首先检测胰岛素对P.a细胞内c-di-GMP表达不同三株实验菌株生长的影响;其次,我们通过96孔微量滴定生物膜分析法,探讨胰岛素对P.a细胞内c-di-GMP表达不同的三株实验菌株形成BF的影响;最后,探讨胰岛素对P.a细胞内c-di-GMP表达不同的三株实验菌株细胞内c-di-GMP合成的影响。在体内研究中,首先建立糖尿病P.a创面感染的小鼠模型,对比观察胰岛素对糖尿病小鼠P.a感染创面的愈合、体重改变、菌量负荷及其对阿米卡星耐药的影响,采用苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色方法来观察胰岛素对糖尿病小鼠P.a感染创面炎症细胞的浸润情况,采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（Real-time Quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测方法检测胰岛素对糖尿病小鼠P.a感染创面组织中白介素-4（Interleukin-4,IL-4）、γ-干扰素（Interferon-γ,INF-γ）RNA相对量表达的影响。采用钛核酸-荧光原位杂交（Peptide nucleic acid-Fluorescence in situ hybridization,PNA-FISH）和荧光素刀豆球蛋白A（Concanavalin A-FITC,ConA-FITC）染色来判断和证实糖尿病P.a创面感染及其BF的存在。体外研究发现:胰岛素促进对照株PAO1和低表达株PAO1/P_lac-yhjH的BF形成,并促进这两株P.a细胞内c-di-GMP表达;说明胰岛素通过促进P.a细胞内c-di-GMP表达来促进BF的合成。体内研究发现:在非糖尿病组中,c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH小鼠创面愈合得快,而c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF的小鼠创面愈合得慢,说明P.a感染创面愈合与P.a细胞内c-di-GMP信号通路有关;在对照株PAO1组和细胞内c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH中,胰岛素可能是通过促进BF形成、中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils,PMNs）浸润及炎症介质的释放,从而影响db/db糖尿病小鼠P.a感染创面愈合;说明胰岛素对P.a创面感染的影响也可能是与细胞内c-di-GMP信号通路有关。第一部分胰岛素对细胞内环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌实验菌株影响的体外研究第一节胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞实验菌株生长的影响目的:观察胰岛素是促进或是抑制c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株的生长。方法:先进行实验菌株复苏,然后增菌、调菌液浓度OD₆₀₀值并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度,进行实验分组,按胰岛素浓度进行分组,胰岛素组最终浓度分别为200nU/ml、200μU/ml、200mU/ml,热变性胰岛素组为对照组;将调整好的菌液混匀、移入24孔板,封口膜封口,37℃,180转/分钟,持续培养,每个观察时间点进行活菌计数。结果:200mU/ml、200μU/ml、200nU/ml的胰岛素浓度比热变性后胰岛素（对照组）干预c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH、对照株PAO1以及c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF,在第4、8、12、24小时时生长的菌落是没有显著差异的。结论:不同浓度的胰岛素及其变性后的胰岛素对c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株生长影响不明显。第二节胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌实验菌株生物膜形成的影响目的:观察胰岛素对c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株BF形成的影响。方法:先进行实验菌株复苏,然后增菌、调菌液浓度OD₆₀₀值并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度,进行实验分组,按胰岛素浓度进行分组,胰岛素组最终浓度分别为200nU/ml、200μU/ml、200mU/ml,热变性胰岛素组为对照组;采用96孔板微量滴定BF分析法进行分析,37℃恒温箱,110转/分钟,持续培养12小时,之后按结晶紫BF半定量检测法进行实验。结果:（1）胰岛素促进c-di-GMP表达不同的P.a实验菌株的BF形成;BF形成增加幅度最大的是c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH,增加15.96%²4.04%;其次为对照株PAO1,增加11.42%到15.71%;c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF的BF增加最少,增加5%¹0%。（2）低表达株PAO1/P_lac-yhjH,在200mU/ml、200nU/ml的胰岛素浓度比变性胰岛素组所形成的的BF明显增多（P<0.01）。对照株PAO1在200mU/ml、200μU/ml的胰岛素浓度比变性胰岛素组所形成的BF明显增多（P<0.05）。而高表达株PAO1ΔwspF,不同胰岛素浓度组比变性胰岛素组所形成的BF有所增多,但差异无统计学意义。结论:胰岛素能够促进c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH和对照株PAO1的BF形成;胰岛素对c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspFBF形成的影响不明显。第三节胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌实验菌株中c-di-GMP表达的影响目的:观察胰岛素对不同P.a实验菌株中c-di-GMP表达的影响。方法:先进行实验菌株(PAO1/P_cdrA-gfp、PAO1/P_lac-yhjH/P_cdrA-gfp、PAO1ΔwspF/P_cdrA-gfp)复苏,然后增菌、调菌液浓度OD₆₀₀值并10倍系列稀释到所需要的菌液浓度,进行实验分组:按胰岛素浓度进行分组,胰岛素组最终浓度分别为200nU/ml、200μU/ml、200mU/ml,热变性胰岛素组为对照组;96孔板微量滴定分析法进行,37℃,185rpm,持续培养12小时,测定OD₆₀₀和gfp的荧光值,将测得的gfp数值除以所测得的OD₆₀₀,就得到RFU。结果:（1）胰岛促进对照株PAO1/P_cdrA-gfp、低表达株PAO1/P_lac-yhjH/P_cdrA-gfp细胞内c-di-GMP的表达;其中,与变性胰岛素组比较,促进c-di-GMP表达增加最多的是低表达株PAO1/P_lac-yhjH,增加36.27%-47.75%;其次是对照株PAO1,增加2.99%-43.13%;但是胰岛素对高表达株PAO1ΔwspF/P_cdrA-gfpc-di-GMP表达的影响不明显。（2）与变性胰岛素组相比较,低表达株PAO1/P_lac-yhjH在200mU/ml、200μU/ml,200nU/ml的胰岛素浓度组明显促进c-di-GMP的表达（P<0.05）;PAO1在200mU/ml胰岛素浓度组也明显促进c-di-GMP的表达（P<0.01）,对c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF的c-di-GMP表达影响不明显。结论:胰岛素能够促进对照株PAO1和c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH细胞内c-di-GMP的表达;对c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF的c-di-GMP表达影响不明显。第二部分胰岛素对糖尿病小鼠创面感染铜绿假单胞菌生物膜形成及环二鸟苷酸调控影响的体内研究第一节细胞内环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌创面感染小鼠模型的建立目的:建立c-di-GMP表达不同的P.a创面感染的小鼠模型,为下一步的研究做好准备。方法:1.实验小鼠准备:雄性、8周龄的db/db糖尿病小鼠,血糖超过20mmol/L为实验组,血糖小于11.1mmol/Ldb/db非糖尿病小鼠作为对照组;在广西医科大学动物房SPF级别进行适应环境饲养1周后开始进行实验;2.体外细菌悬浮液的准备:先进行实验菌株复苏,然后增菌、调菌液浓度OD₆₀₀值并10倍系列稀释到我们所需要的浓度;3.手术当天先对小鼠进行麻醉、备皮、消毒、无菌眼科剪刀将去除小鼠背部约1.5 x1.5cm大小的全层皮肤,无菌半透明敷贴覆盖,100μl实验菌株于外科膜下创面的上面之间注射,建立慢性P.a创面感染的小鼠模型。结果:术后第3天左右可见外科膜下有脓液形成即成功建立c-di-GMP表达不同的P.a创面感染的小鼠模型,为下一步的研究做好准备。结论:采用db/db小鼠,成功建立c-di-GMP表达不同的P.a创面感染小鼠模型。第二节胰岛素对环二鸟苷酸表达不同的铜绿假单胞菌创面感染小鼠模型观察指标影响的检测目的:对比观察胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面愈合、体重改变、菌量负荷及其对阿米卡星耐药的影响,观察胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面P.aBF形成、炎症细胞的浸润以及炎症介质释放表达的影响。方法:我们先前已经建立糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a创面感染的动物模型,观察实验前及每个观察时间点测量胰岛素后糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面情况、创面愈合和体重变化的影响,采用平板计数法,检测胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面菌量负荷情况及其对阿米卡星耐药的影响,采用HE染色来观测胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面炎症细胞浸润情况;采用PNA-FISH和ConA-FITC染色来判断、证实糖尿病慢性c-di-GMP表达不同的感染创面P.a及其BF的存在;采用RT-qPCR检测方法检测胰岛素对糖尿病小鼠c-di-GMP表达不同的P.a感染创面炎症介质的影响。结果:（1）在c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH组中,非糖尿病组P.a感染创面愈合得最快,糖尿病+胰岛素组比糖尿病组愈合得慢;而在对照株PAO1组的术后第16天,糖尿病+胰岛素组比糖尿病组愈合得慢;P.a感染创面愈合得最慢是c-di-GMP高表达株PAO1△wspF组。（2）在c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH组术后第4天、第16天中,糖尿病+胰岛素组创面感染的P.a对阿米卡星的耐药率比糖尿病组显著增高。（3）在c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH组中,糖尿病+胰岛素组的P.a创面感染中,能看到更多PMNs的侵润、更多BF形成和更多炎症介质释放。但是胰岛素对c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF组创面愈合、BF形成方面影响不明显。结论:（1）在非糖尿病组中,c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH小鼠创面愈合得快,而c-di-GMP高表达株PAO1ΔwspF的小鼠创面愈合得慢,说明P.a感染创面愈合与P.ac-di-GMP信号通路有关;（2）在对照株PAO1和c-di-GMP低表达株PAO1/P_lac-yhjH的糖尿病组中,胰岛素可能通过促进BF形成、PMNs浸润及炎症介质的释放,从而影响糖尿病小鼠P.a创面愈合;说明胰岛素对P.a创面感染的影响也可能是与细胞内c-di-GMP信号通路有关。