【摘 要】
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研究表明,肠道菌群代谢产物与机体代谢具有紧密联系,TMAO（氧化三甲胺）是胆碱经肠道菌群的主要代谢产物之一。低水平TMAO具有稳定蛋白质、核酸结构和细胞体积等积极作用。高浓度TMAO具有明显危害性,被认为是动脉粥样硬化、糖尿病等慢性疾病的促进物。细胞焦亡是一种由Gsdermin蛋白家族介导的促炎性细胞程序性死亡,发生于大多数细胞。癌细胞、受感染细胞通过焦亡来维持机体稳态,但一般体细胞的焦亡伴随的炎
【基金项目】
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“十四五”国家重点研发计划（编号:YFF1000602）；
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研究表明,肠道菌群代谢产物与机体代谢具有紧密联系,TMAO（氧化三甲胺）是胆碱经肠道菌群的主要代谢产物之一。低水平TMAO具有稳定蛋白质、核酸结构和细胞体积等积极作用。高浓度TMAO具有明显危害性,被认为是动脉粥样硬化、糖尿病等慢性疾病的促进物。细胞焦亡是一种由Gsdermin蛋白家族介导的促炎性细胞程序性死亡,发生于大多数细胞。癌细胞、受感染细胞通过焦亡来维持机体稳态,但一般体细胞的焦亡伴随的炎性会成为疾病的诱因。脂肪细胞的焦亡会伴随脂肪组织低度炎症,这可能会加剧其它相关性疾病的发生发展。此外,TMAO已被证明促进血管上皮细胞焦亡,激活多种细胞的Nlrp3炎性小体,但TMAO调节脂肪细胞的作用研究还存在空缺。本研究在体内给小鼠喂食高胆碱饲粮,体外用高浓度TMAO处理脂肪细胞,通过ELISA、WB、qPCR、IF等技术对TMAO调节脂肪细胞焦亡的作用机制展开探究。为TMAO调节脂肪细胞能量代谢和生命活动的作用研究提供基础数据,为改善脂肪组织氧化应激和低度炎症提供新参考。为肠道菌群代谢物调节脂肪细胞的作用提供新靶点,为肉品质改良和优质猪种选育提供新方向。主要得到以下结果:1.高胆碱饮食增加体内TMAO浓度,促进脂肪细胞氧化应激。高剂量（5%）胆碱饮食增加体内血液、肝脏、脂肪组织的TMAO水平（P＜0.05）;上调胆碱-TMAO代谢关键因子FMO3、cut C/D的表达水平（P＜0.05）;给小鼠灌胃丁酸梭菌提高血液、肝脏TMAO浓度,促进cut C/D的表达水平（P＜0.05）。此外,高胆碱饮食组小鼠的脏器没有出现明显病理性变化,但脂肪组织的体积存在明显减小。高胆碱饮食和体外300μM TMAO处理均显著抑制脂肪组织/脂肪细胞中抗氧化酶基因Sod2、Gpx1、CAT的m RNA和Sod2蛋白水平（P＜0.05）,也下调线粒体标志物Ndufa9、Sdha等m RNA和COXIV、ATP5A1蛋白水平（P＜0.05）;同时降低SOD酶活（P＜0.05）,增加过氧化标志物MDA含量（P＜0.05）;TMAO促进脂肪细胞ROS产生,抑制ATP的生成（P＜0.05）。此外,在猪原代脂肪细胞中也检测到相似的结果（P＜0.05）。以上数据表明,高胆碱饮食增加体内TMAO浓度,促进脂肪细胞氧化应激。2.高浓度TMAO导致脂肪细胞Nlrp3依赖性焦亡。高胆碱饮食组（HC）脂肪组织的HE染色观察到明显的冠状结构,促炎因子IL-6、TNF-α和i NOS的表达水平显著升高,说明高胆碱饮食引起脂肪组织炎症反应。高胆碱饮食和高浓度TMAO处理明显上调了cleaved-Casp1、GSDMD和mature-IL-1β等因子的表达（P＜0.05）;增加了胞外IL-1β和LDH的释放（P＜0.05）;细胞核出现明显碎片化;用Nlrp3特异性抑制剂MCC950预处理细胞能显著缓解由TMAO引起的上述变化（P＜0.05）。在猪原代脂肪细胞中检测到相似变化,包括焦亡标志因子的表达上调,IL-1β胞外释放增加,上调TNFα、i NOS和IL-6水平增加（P＜0.05）。以上结果显示,高浓度TMAO导致Nlrp3依赖性脂肪细胞焦亡。3.高浓度TMAO通过Nrf2/ROS/Nlrp3炎症小体途径调节脂肪细胞焦亡。用ROS清除剂Tempol预处理细胞,明显抑制TMAO引起的氧化应激（ROS产生、ATP含量SOD酶活等）和Nlrp3蛋白水平（P＜0.05）。高胆碱饮食和高浓度TMAO均显著抑制Nrf2表达（P＜0.05）;Nrf2的激活剂DMF处理显著上调了Sod2、CAT等m RNA和Nrf2、Sod2蛋白水平。同时,药物激活Nrf2后,焦亡关键因子Nlrp3水平和IL-1β释放被显著减少（P＜0.05）;相反的是,药物抑制Nrf2会加剧TMAO的上述作用（P＜0.05）。此外,过表达Gsta4能缓解TMAO引起的氧化应激和焦亡,包括抗氧化酶基因Sod2、CAT、Gpx1等水平升高（P＜0.05）、ROS产生减少（P＜0.05）、焦亡关键因子Nlrp3、cleaved-Casp1和mature-IL-1β的表达水平下调（P＜0.05）。这些结果证明,TMAO通过Nrf2/ROS/Nlrp3炎症小体途径调节脂肪细胞焦亡。综上,高胆碱饮食通过增加体内TMAO浓度,引起脂肪细胞氧化应激,进而导致脂肪细胞Nlrp3依赖性焦亡。并且,增加肠道丁酸梭菌能够通过上调胆碱裂解酶基因cut C/D水平促进TMAO产生。高浓度TMAO通过Nrf2/ROS/Nlrp3炎症小体途径调节脂肪细胞焦亡,增加细胞抗氧化能力抑制上述作用。这些结果为肠道菌群代谢物调节脂肪细胞的作用提供新靶点,为肉品质改良提供新参考。
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