【摘 要】
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LAT1（Large neutral amino acids transporter small subunit 1）是由SLC7A5（Solute carrier family 7 member 5）基因编码的一种不依赖Na+和p H的转运蛋白,具有亮氨酸、色氨酸等氨基酸（Amino acid,AA）转运活性,参与羧酸、甲状腺激素转运及外源性运输,与糖蛋白4F2hc（4F2 cell-surfa
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:31702098）； 国家自然科学基金（编号:31672398）； 陕西省重点研发计划（编号:2018ZDCXL-NY-01-05）；
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LAT1（Large neutral amino acids transporter small subunit 1）是由SLC7A5（Solute carrier family 7 member 5）基因编码的一种不依赖Na+和p H的转运蛋白,具有亮氨酸、色氨酸等氨基酸（Amino acid,AA）转运活性,参与羧酸、甲状腺激素转运及外源性运输,与糖蛋白4F2hc（4F2 cell-surface antigen heavy chain）二硫键相结合形成复合物转运亮氨酸等必需氨基酸,通过调节AA的摄取来调控细胞的生长。本实验室前期对极端高低乳蛋白率、乳脂率萨能奶山羊乳腺组织转录组测序揭示SLC7A5基因为调控乳蛋白和乳脂合成的关键候选基因,故本研究以奶山羊乳腺上皮细胞（Goat mammary epithelial cells,GMECs）、SLC7A5基因编码区（CDS）为试验材料,通过构建过表达载体及合成干扰RNA,转染GMECs探究SLC7A5基因对GMECs乳蛋白和乳脂合成的影响;通过干扰SLC7A5基因后,AA或Leu刺激不同时间探究SLC7A5基因对AA或Leu刺激的m TOR信号通路的影响;通过挽救试验探究SLC7A5基因调控乳蛋白和乳脂合成的机制。获得如下主要研究结果:1、SLC7A5基因对GMECs乳蛋白和乳脂合成关键基因表达的影响成功构建重组真核表达质粒p EGFPC1-SLC7A5及合成并筛选出si RNA-1063对SLC7A5基因的沉默效果最好。在GMECs中过表达SLC7A5基因,乳蛋白相关基因CSN1S1的m RNA及蛋白表达均显著上调（P＜0.05）;乳脂合成相关基因SCD1、C/EBPβ、ACACA的m RNA表达水平显著上调（P＜0.05）,脂滴积累增加。干扰SLC7A5基因,乳蛋白相关基因CSN1S1的m RNA及蛋白表达均显著下调（P＜0.05）;乳脂合成相关基因SCD1、FASN、C/EBPβ的m RNA表达水平显著下调（P＜0.05）,脂滴积累减少。综上,SLC7A5基因对GMECs乳蛋白和乳脂合成具有正调控作用。2、GMECs中干扰SLC7A5基因对AA/Leu刺激的m TOR信号通路的影响干扰SLC7A5基因后,m TOR的活性受到显著抑制,且S6K、S6的磷酸化水平均显著降低（P＜0.05）;在AA或Leu刺激下,随着刺激时间的延长,干扰组与对照组的S6K、S6的磷酸化水平均逐渐增强,但干扰组的两个蛋白磷酸化水平增强幅度小于对照组。由此可知,SLC7A5基因通过调控AA特别是Leu的摄取,对m TOR信号通路进行调控,抑制SLC7A5基因表达在一定程度上减弱了GMECs对AA或Leu的摄取,进而减弱了m TOR信号通路的作用。以上结果表明SLC7A5基因在AA特别是Leu的刺激下能够激活m TOR信号通路,进而对生物学过程发挥调控作用。3、SLC7A5基因通过m TOR信号通路调控GMECs的乳蛋白和乳脂合成在GMECs中过表达SLC7A5基因的同时添加m TOR抑制剂Trion1,结果显示,与单独过表达SLC7A5组相比CSN1S1的m RNA表达水平下调,蛋白结果与荧光定量结果一致。但在干扰SLC7A5的同时添加m TOR激动剂MHY1485,与单独干扰SLC7A5组相比CSN1S1的m RNA表达水平未回升;蛋白结果回升效果不显著。这可能是由于细胞SLC7A5减少后AA的可用性降低导致翻译过程无法持续进行。乳脂相关基因检测结果表明,同时过表达SLC7A5基因并添加Torin1时,SCD1、FASN的m RNA表达水平有所降低,干扰SLC7A5基因的同时添加MHY1485,SCD1、FASN的m RNA结果一致。这揭示了在GMECs中SLC7A5基因可能通过正向调控m TOR信号通路促进αs1-酪蛋白的合成,影响乳蛋白的合成;SLC7A5基因可能通过m TOR信号通路调控SCD1、FASN基因的表达,影响乳脂的合成。本研究揭示了SLC7A5基因通过m TOR信号通路调控GMECs乳蛋白和乳脂的合成。研究结果为深入探究GMECs乳蛋白、乳脂合成分子机制,完善奶山羊乳成分合成代谢分子调控网络,进而提高羊乳品质提供了理论依据。
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