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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,也是女性第二常见的癌症导致死亡的原因,严重影响了女性的身心健康。目前乳腺癌的治疗方法主要包括手术、放射治疗、化疗、靶向药物治疗及内分泌治疗等。在乳腺癌中,仅放疗就可使早期患者的10年复发风险降低一半,使15年乳腺癌相关死亡风险降低六分之一。尽管如此,在接受放射治疗的患者中,仍有8%-15%的乳腺癌患者局部控制失败,因此寻找导致治疗失败的放疗固有或获得性抵抗是一个重要的临床问题。microRNA是一类广泛存在于动植物体内的非编码小RNA,主要参与基因转录后水平调控。已有多项研究表明,多种miRNAs在乳腺癌的发生、发展、转移和侵袭中发挥着关键作用。也有研究报道一些miRNAs在乳腺癌的放射治疗中具有促进抗辐射或增加敏感性等作用。miR-634作为miRNAs的成员,已有研究表明miR-634会调控其他恶性肿瘤的增殖、迁移及药物敏感性等。但是miR-634在人乳腺癌细胞辐射抵抗中的作用鲜少有研究。在本课题中,我们对miR-634在人乳腺癌细胞放疗敏感性的影响以及分子调控机制进行了深入的研究,为乳腺癌的放射治疗提供新的思路。目的:初步研究miR-634在辐射抵抗的人乳腺癌细胞中的表达情况,进一步探讨miR-634对人乳腺癌细胞放疗敏感性的影响及其分子调控机制。方法:1.构建辐射抵抗的人乳腺癌细胞后,采用不同剂量的X射线分别照射MCF-7与 MCF-7/R 以及 MDA-MB231 与 MDA-MB231/R 细胞,采用(0,1,2,4,6,8Gy)辐射剂量分别照射四组细胞,用MTT实验方法分别检测四组细胞的存活率,并通过qRT-PCR 检测 MCF-7 与 MCF-7/R 以及 MDA-MB231 与 MDA-MB231/R 细胞中的miR-634的表达情况。2.利用细胞转染技术分别构建miR-634 mimics、Control mimics和miR-634 inhibitor 和 NC inhibitor 的 MCF-7/R 和 MDA-MB-231/R 细胞,采用(0,1,2,4,6,8Gy)辐射剂量分别照射转染了 miR-634 mimics/Control mimic 或 miR-634 inhibitor/NC inhibitor的MCF-7/R和MDA-MB-231/R细胞,通过MTT实验检测各组细胞的存活率。3.分别将转染了 miR-634 mimics/Control mimic 或 miR-634 inhibitor/NC inhibitor的MCF-7/R和MDA-MB-231/R细胞暴露于辐射剂量(4 Gy)下,24小时后进行流式细胞检测细胞凋亡率,并通过蛋白质印迹法分别对MCF-7/R和MDA-MB-231/R的四组细胞的凋亡相关因子Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达进行检测。4.使用TargetScan软件程序预测miR-634能与STAT3结合后,应用双荧光素酶报告实验验证miR-634是否为STAT3的潜在靶向miRNA。进一步通过蛋白质印迹法、MTT实验、细胞转染、流式细胞检测等实验方法进一步验证miR-634可负性调控STAT3,以及对放疗敏感性的影响。结果:1.采用(0,1,2,4,6,8Gy)辐射剂量照射 MCF-7 和 MDA-MB-231 以及 MCF-7/R和 MDA-MB-231/R 细胞,MTT 结果显示 MCF-7、MDA-MB-231、MCF-7/R 和MDA-MB-231/R细胞的存活率均有降低。但与MCF-7/R和MDA-MB-231/R相比,MCF-7和MDA-MB-231细胞的存活率显著减少(P<0.01)。与MCF-7和MDA-MB-231细胞相比,MCF-7/R和MDA-MB-231/R细胞中miR-634的表达水平显著降低(P<0.01)。2.MTT结果显示在同种辐射、相同剂量条件下,在MCF-7/R和MDA-MB-231/R细胞中,与对照模拟组相比,过表达miR-634显著降低了辐射抵抗细胞的存活率(P<0.01)。3.在MCF-7/R与MDA-MB-231/R细胞中,miR-634 mimics组的凋亡率显著高于对照组(P<0.01),而miR-634 inhibitor组的凋亡率显著低于NC抑制剂组(P<0.05,P<0.01)。蛋白质印迹法结果显示,在MCF-7/R与MDA-MB-231/R细胞中,miR-634 mimics 组中 Cleaved caspase-3 和 Cleaved PARP 的表达明显高于对照组(P<0.01),miR-634 inhibitor组中这两种蛋白的表达水平显著低于对照组(P<0.01)。4.miR-634 mimics显著降低了转染STAT3-WT质粒的细胞的荧光素酶活性(P<0.01),而转染STAT3-MUT质粒的细胞的荧光素酶活性没有差异。这表明miR-634能够结合STAT3。蛋白质印迹法结果显示,在miR-634 mimics组中STAT3被有效地下调(P<0.01),相反,在miR-634 inhibitor组中STAT3的表达增加(P<0.01)。5.MTT实验检测不同剂量辐照处理的Control mimics+Vector组,miR-634 mimics+Vector 组和 miR-634 mimics+STAT3组等三组 HEK-MCF-7/R 细胞的存活率,结果显示miR-634 mimics+Vector 组的存活率与 Control mimics+Vector 组和 miR-634 mimics+STAT3组相比显著降低(P<0.01),进一步应用流式细胞术检测Control mimics+Vector 组,miR-634 mimics+Vector 组和 miR-634 mimics+STAT3 组等三组HEK-MCF-7/R细胞的凋亡情况。结果显示miR-634 mimics+Vector组的H/R-MCF-7/R细胞凋亡率明显高于其他两个Control mimics+Vector组和miR-634 mimics+STAT3组(P<0.01)。蛋白质印迹法检测 Control mimics+Vector 组,miR-634 mimics+Vector组和 miR-634 mimics+ STAT3 组等三组 HEK-MCF-7/R 细胞中 STAT3,Cleaved caspase-3 和 Cleaved PAPR 的相对蛋白表达量。结果显示,miR-634 mimics+STAT3组的STAT3表达显著上调(P<0.01),但miR-634 mimics+Vector组的STAT3表达下调(P<0.01)。在 miR-634 mimics+Vector 组中,Cleaved caspase-3 和 Cleaved PARP的表达水平显著增加(P<0.01),而在 miR-634 mimics+STAT3 组中,Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的表达水平显著降低(P<0.01)。结论:miR-634在辐射抵抗的人乳腺癌细胞中表达下调,并能通过靶向调控STAT3发挥其肿瘤抑制作用。