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由于陆生放线菌50多年的研究,其活性天然产物发现重复几率已达95%。海洋占地球面积70%,研究发现海洋来源的放线菌多数能够产生抗菌、抗肿瘤等活性代谢产物,且很多为新颖先导化合物,已经引起广泛重视。我国是海洋大国,海域面积辽阔,但对沉积环境海洋放线菌资源的系统研究非常有限。南海是中国最大的热带边缘海,海底沉积环境复杂多样,生物资源丰富,对远海沉积环境放线菌资源的研究目前仍是空白。本文主要从纯培养和免培养的角度,对南海北部沉积环境放线菌多样性及其资源分布情况进行探索性研究,以评价其资源储备和开发潜力。
本文首先从海洋放线菌研究历史入手,对目前海洋放线菌分离培养方法、代谢产物、生态功能以及基因组研究等情况进行了综述。分析了我国海洋放线菌研究存在的诸多问题,并展望了我国海洋放线菌资源研究的美好前景。
分离是获得纯培养的唯一手段,获得纯培养是研究微生物生物学功能的必要途径。本项目以多年采集的南海北部沉积物样品为基础,通过设计、改良放线菌选择性培养基和预处理方法,对南海北部沉积环境放线菌数量分布以及生理学特性进行研究。初步研究发现,6种碳源和5种氮源有利于海洋放线菌的分离,温度处理能显著提高放线菌出菌率和抑制非目的菌生长,最适的盐耐受范围低于5%。从南海北部沉积环境共分离、保藏放线菌菌株1100多株,初步建立南海沉积环境放线菌分离方法。
通过形态特征合并菌株后,对其中的216株进行初步鉴定,发现了放线菌纲下7个目13个科的22个属级类群下的80个种,其中新物种14个。通过形态学、生理生化、细胞化学和分子分类等多相分类方法,已经对其中的5个完成了系统学研究,描述并发表了南海所放线菌属(Sciscionel)和海洋产孢放线菌属(Marinactionspora)2个新属和1个新种。其它10个新分类单元的系统分类工作正在进行中。
根据纯培养结果分析各种分离培养基获得海洋放线菌多样性情况以及南海北部沉积环境海洋放线菌多样性及其区域分布特征。研究发现高氏1号培养基获得最多属的放线菌类群,而小单孢和链霉菌在南海北部沉积环境广泛分布,其物种丰富多样,为该海域沉积环境环境优势放线菌类群。在4个潜在冷泉沉积环境发现了13个已知放线菌属和2个新属,显示出十分丰富的放线菌多样性以及新的物种资源。
通过水解酶活性,抗菌和抑制海虾生长活性以及活性代谢产物合成酶基因筛选,发现具有水解酶活性的菌株占92%;具有抑菌和海虾生长活性的菌株占83%,活性代谢产物基因簇的筛选发现其阳性比率达78%。显示出78%以上的海洋来源的放线菌具有特殊的功能。
选择特异性引物扩增环境中放线菌16S rRNA基因片段,通过优化DGGE分析条件,获得南海北部11个沉积物样点的放线菌DGGE清晰图谱。通过比较图谱中各个样点的共有的、优势的和各自特有条带,共确定41个条带类型,根据条带克隆测序,发现其中的22个条带的28个克隆为放线菌类群。系统进化分析发现28个放线菌克隆子的10个与经典的放线菌亚目的7个已知属聚在一起,另外其中的1个克隆形成一个单独分支。其它18个克隆子与酸微菌亚纲显示了较近的亲缘关系,但精确的系统进化地位仍然有待确定。
初步的研究结果显示,南海北部沉积环境放线菌多样性丰富,特别是各种特殊沉积环境存在高级的新物种,资源开发潜力较大。