目的:Fe₃O₄纳米粒子（nanoparticles）即磁性氧化铁纳米粒子,具有过氧化物酶样活性,在临床上已成功应用于各种诊断手段。然而,关于Fe₃O₄纳米粒子的治疗应用的报道很少,原因是其对底物H₂O₂的亲和力较低。本文报道了能使Fe₃O₄纳米粒子类过氧化物酶活性增强和对底物H₂O₂亲和力提高的一种新策略,此方法可以产生促进肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）凋亡的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,进而使Fe₃O₄纳米粒子在人肾癌治疗方案中提供了一个新途径,为提高人肾癌治疗疗效提供实验和理论依据。材料和方法:在本实验中我们对RCC的A-498细胞株进行体外培养,HEK-293正常细胞作为对照,实验动物选为巴比赛（BALB/C）裸鼠。首先,采用水热法合成了Fe₃O₄纳米粒子,并对其合成过程进行了一些改良。用相同的方法,合成Co@Fe₃O₄纳米粒子,但是需要在反应体系中额外加入0.82g的Co（NO₃）₃·6H₂O。用透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM）、动态光散射（Dynamic light scattering,DLS）对Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子的形态和结构图像进行了表征。而后用TMB与H₂O₂在过氧化物酶样活性条件下产生蓝色沉淀的原理,证明Co@Fe₃O₄纳米粒子的过氧化物酶样活性。在iMark^TM酶标检测仪（Bio-Rad,美国）上以时间进程为模式,室温下监测652nm处的吸光度变化,测定了Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子的动力学参数。在常温下使用Bruker电子自旋共振（ESR）光谱仪（A300-10/12,德国）进行ESR测量。在CCK-8细胞活力试剂盒（Dojindo分子技术）中添加10nmol/L H₂O₂来测定Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子的肾癌细胞存活率。用荧光探针2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（H₂DCFDA）测定由Fe₃O₄或Co@Fe₃O₄纳米粒子产生的细胞内活性氧。通过共聚焦激光扫描显微镜探究人肾癌细胞中Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子的吸收和分布。通过PI/膜联蛋白V双染色法和流式细胞术（Fascaliburtm）对治疗后的肿瘤细胞进行凋亡分析。同时用人正常肾上皮细胞（HEK-293细胞）作为对照。最后,将15只种有A-498细胞株的巴比赛（BALB/C）裸鼠随机分为3组（n=5/组）。所有小鼠均经抗肿瘤治疗。当肿瘤的直径大约200mm³时,给予单一剂量的Fe₃O₄或Co@Fe₃O₄纳米粒子（3mg/ml,100μL）,混合以10nmol/L的H₂O₂进行治疗。对照组给予生理盐水对照治疗。肿瘤大小及小鼠体重每隔2天记录1次,肿瘤体积计算[mm³]V=长×宽²×1/2。结果数值采用平均值±SD。结果:Co@Fe₃O₄纳米粒子的EDX光谱显示纳米粒子中存在铁和钴元素。通过能量成分能谱（Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy,EDX）分析,确定了Co@Fe₃O₄纳米粒子中铁和钴元素的含量分别为33.48%和16.23%,其比例约为2:1。通过TEM、SEM和X射线衍射（X-ray diffraction,XRD）来研究Co@Fe₃O₄纳米粒子的结构,结果显示大多数Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子是球形的。TEM显示Fe₃O₄纳米粒子的平均大小为89.8±7.9nm,而Co@Fe₃O₄纳米粒子的平均大小为94.6±8.6nm。动态光散射（Dynamic Light Scattering,DLS）结果显示,Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子水合粒径分别为90.31±0.62nm及95.82±3.57nm。XRD图谱中,Co@Fe₃O₄纳米粒子的每一个特征衍射峰与Fe₃O₄的每一个特征衍射峰相似,表明Co@Fe₃O₄纳米粒子中的共掺杂不影响Fe₃O₄的时相形态。使用过氧化物酶底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）和H₂O₂进行了经典的催化实验。结果表明,Fe₃O₄和Co@Fe₃O₄纳米粒子均能催化TMB与H₂O₂的氧化反应,生成吸光度为652nm的蓝色产物。此外,结果表明,与Fe₃O₄纳米粒子相比,Co@Fe₃O₄纳米粒子的过氧化物酶活性有显著提高,表明在Fe₃O₄纳米粒子中掺杂Co可以显著提高纳米粒子的催化活性。为了获得Co@Fe₃O₄纳米粒子的表观动力学参数,我们进行了米氏-门汀实验。Co@Fe₃O₄纳米粒子对H₂O₂的Km常数远低于Fe₃O₄和Co₃O₄纳米粒子,表明Fe₃O₄纳米粒子掺杂后底物亲和力显著提高。更重要的是,辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和Fe₃O₄纳米粒子对H₂O₂的Km值分别是Co@Fe₃O₄的100倍和500倍,表明Co@Fe₃O₄纳米粒子对H₂O₂的亲和力比HRP和其他纳米粒子高。Co@Fe₃O₄纳米粒子对H₂O₂的最大初始反应速率亦显著提高。经典的活性氧荧光染料2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（H₂DCFDA）检测肿瘤细胞内的活性氧水平。仅用10nmol/L的H₂O₂处理的肿瘤细胞没有显示出明显的ROS信号。用Fe₃O₄纳米粒子和10nmol/L的H₂O₂培养后,绿色荧光强度有所增加。然而,用Co@Fe₃O₄纳米粒子和10nmol/L的H₂O₂处理的人肾癌细胞呈现出非常强的绿色荧光亮度,表明Co@Fe₃O₄纳米粒子催化H₂O₂分解产生一个ROS爆发,引发细胞凋亡。用Co@Fe₃O₄纳米粒子和10nmol/L的H₂O₂处理的肿瘤细胞显示出明显的凋亡模式。在相同浓度的纳米粒子刺激下,Co@Fe₃O₄纳米粒子诱导肾癌细胞凋亡的数量明显高于Fe₃O₄纳米粒子。经过人正常肾上皮细胞对照,Co@Fe₃O₄纳米粒子对正常肾细胞的损伤较小及引起较轻微的细胞凋亡。为了进一步评估Co@Fe₃O₄纳米粒子在体内环境中的抗肿瘤活性,我们应用A-498细胞株接种于异种裸鼠作为肿瘤患病模型。Co@Fe₃O₄纳米粒子对荷瘤小鼠表现出显著的肿瘤抑制作用。而Fe₃O₄纳米粒子处理的小鼠,因其低过氧化物酶活性及与底物H₂O₂亲和力低,与生理盐水对照后显示无差别特异性。结论:1.Fe₃O₄纳米粒子掺杂Co后基本不影响Fe₃O₄纳米粒子的时相形态。2.Co@Fe₃O₄纳米粒子的过氧化物酶样活性呈pH值依赖性。3.掺杂Co是一种有效、简便易行的提高Fe₃O₄纳米粒子过氧化物酶样活性的方法。4.Co@Fe₃O₄纳米粒子的抗肾癌治疗活性主要通过刺激·OH的产生来达到其抗肾癌的目的。5.Co@Fe₃O₄纳米粒子对正常肾细胞或组织杀伤力较小。6.通过体外及体内实验证实了Co@Fe₃O₄纳米粒子的抗肾癌治疗的可行性及安全性。