结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是西方国家一个严重的健康问题,是发达国家和发展中国家发病率排名第三的肿瘤。男性结直肠癌发病率排在肺癌和前列腺肿瘤之后,其高发年龄是50-65岁。结直肠癌在女性仅次于乳腺癌,占据第二位的发生率。全世界每年大约有一百万新发病例,约有550000男性和470000女性,这表明结直肠癌正在成为一个越来越重要的公共卫生问题。结直肠癌约占所有肿瘤的13%,与许多其他癌症相似,在发展中地区和发达地区表现出差异。与此同时,在过去的20年中,由于外科技术的进步,同时使用辅助化疗、放疗技术的提高以及一级和二级预防运动的改进,结直肠癌的生存期有所增加并且死亡率减少。大约有50%新诊断患者会进展为转移性癌症,且约50—60%的可达到平均五年的生存期。一般情况下,结直肠癌确诊时已到晚期,这是由于快速转移导致,因此通过血液形成的高转移率,是实现更有效治疗的主要障碍之一。结直肠癌发病率在世界不同地区存在差异,这些地理性差异可能是由于在不同地区人群的基因遗传和当地的饮食习惯存在不同。结直肠癌的危险因素包括：个人和家族遗传史及环境和饮食习惯。有以下疾病的人群较一般人群发病率高2-3倍,如肠道的良性或恶性肿瘤家族史、腺瘤、女性45岁之前罹患癌症如卵巢、子宫和乳房癌症。值得注意的是至少15%的结直肠癌有家族聚集现象。结直肠癌的发病机理以及肿瘤进展过程中涉及的分子较为复杂,这是由于调控上皮细胞进展和细胞分化的基因突变累积的结果。结直肠癌根据起源和表现形式的不同可以分为以下三种类型：(1)散发类型,指不存在基因突变但存在易感性,不显示出任何家族遗传性。60-80%的结直肠癌,是散发类型。(2)家族聚集类型,没有相关的基因被发现,约占20-40%的病例。人口研究表明,存在散发型结肠癌有血缘关系的家庭成员时,结直肠癌发病风险是普通人群的两到三倍。(3)遗传类型,腺瘤息肉的存在与否可以区分两种肿瘤变异的倾向。1)家族性腺瘤息肉病(FAP)患者存在多个息肉,若不进行预防性手术,在40岁时,一个或多个腺瘤可能成为恶性肿瘤；2)遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC),是一种恶性肿瘤,发展为非消化道癌症的风险非常高。近来,天然中草药物副作用小,用于治疗包括癌症在内的各类疾病,正成为一种新型抗癌药物而备受关注。因此,新天然药物的出现或许可为抗癌治疗提供一个新方法。氯化两面针碱(Nitidine Chloride, NC),是中草药两面针中的重要成分。研究表明,氯化两面针碱有多种生物活性,包括抗炎、抗疟、抗菌、止痛及抗癌症活性,而最近研究表明氯化两面针碱可以通过促进细胞凋亡抑制人类肿瘤发生及进展。氯化两面针碱可抑制周期蛋白B1(Cyclin B1)和p53依赖性通路,使细胞G2/M期阻滞,进而抑制多种癌细胞的生长。另有研究发现氯化两面针碱可通过调控JAK1/STAT3信号途径抑制肝肿瘤细胞生长。此外,氯化两面针碱可以通过c-Src/FAK相关通路抑制肝癌细胞和肾癌细胞的增生以及乳腺癌细胞的转移。多方面证据表明,丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路是结直肠癌细胞增殖的主要调节途径,在结肠癌的发生、发展中发挥重要作用。MAPK家族有三个成员：细胞外信号调节激酶(Ras/Raf1/MEK/ERK)、c-Jun N端或应激激活蛋白激酶(JNK或SAPK)和p38家族。许多证据表明MAPK途径参与人类结直肠癌肿瘤细胞的侵袭和转移过程,而且MAPK信号通路的抑制剂作为新的抗结直肠癌药物,正处于临床实验阶段。本研究探讨了氯化两面针碱对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响,发现氯化两面针碱能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖,促进结直肠癌细胞的凋亡；抑制细胞增殖的机制主要是阻断MAPK信号通路,同时激活了Bax、caspase等凋亡相关蛋白,促进细胞的凋亡。以上结果表明,氯化两面针碱有可能成为新的临床化疗药物,从而为改善结直肠癌的预防及治疗提供价值。研究目的1.探讨氯化两面针碱对结直肠癌细胞生长和增殖的影响；2.探讨氯化两面针碱对结直肠癌细胞凋亡的影响；3.探讨氯化两面针碱对结直肠癌细胞影响的相关机制。研究方法直肠癌细胞株采用人HCT116,MTT实验用来评估细胞的生存能力和增殖活性。Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)及TUNEL实验实验测定分析凋亡。Western blot实验分析蛋白。本数据采用均数±标准偏差(SD)表示。所有实验均至少重复三次。单因素方差分析被用于各组间的比较。不同组间的差异分析采用T检验。当P<0.05时,数据结果具有统计学意义。研究结果1.氯化两面针碱(NC)抑制结直肠癌细胞的增殖MTT试验用来探讨氯化两面针碱(NC)对结直肠癌细胞增殖的作用。氯化两面针碱以时间和剂量依赖性的方式,抑制结直肠癌细胞的增殖。为进一步评估结果,[3H]胸苷吸收实验被用来检测氯化两面针碱对结直肠癌细胞增殖的影响。结果表明,氯化两面针碱(NC)在一系列浓度(5、10和20gM)范围内可以显著抑制结直肠癌细胞的增殖。由于氯化两面针碱(NC)浓度达到10和20μM时的显著影响,这些浓度(10和20μM)的NC被选择应用于随后的实验。以上数据表明NC可有效抑制结直肠癌细胞增殖。2.氯化两面针碱(NC)抑制结直肠癌细胞中ERK的磷酸化氯化两面针碱能够显著抑制细胞增殖,接下来本课题组探讨了氯化两面针碱抑制细胞增殖的机制。MAPK信号通路在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。本课题组分别以10和20μM的NC浓度处理细胞24h后,检测了MAPK信号通路相关蛋白的表达。结果表明氯化两面针碱处理细胞后,ERK磷酸化水平下降,表明氯化两面针碱有可能作用于ERK抑制细胞增殖。3.氯化两面针碱(NC)诱导结直肠癌细胞的凋亡为证实氯化两面针碱(NC)对结直肠癌细胞的增殖抑制作用,是氯化两面针碱诱导结直肠癌细胞凋亡所致,我们用氯化两面针碱(NC)处理结直肠癌细胞24小时。然后以Annexin V-FITC/PI实验分析癌细胞凋亡,结果显示,当氯化两面针碱(NC)浓度为10和20uM时,可有效地增加结直肠癌细胞凋亡。当以10和20uM浓度的氯化两面针碱处理24小时后,结直肠癌凋亡死亡率从6.9%±1.3%上升至34.8%±6.8%,36.9%±7.2%。TUNEL实验用来评估细胞凋亡中裂解的DNA碎片。我们用氯化两面针碱(NC)处理结直肠癌细胞24小时后,将这些肿瘤细染色,并在荧光光谱显微镜下观察,10和20uM浓度的氯化两面针碱(NC)可显著增加癌细胞凋亡。氯化两面针碱(NC)处理结直肠癌细胞后出现显著的诱导癌细胞凋亡现象,证实了氯化两面针碱的抗癌作用。4.氯化两面针碱(NC)通过改变Bcl-2家族蛋白和激活caspase诱导结直肠癌细胞的凋亡既然氯化两面针碱能够诱导细胞凋亡,接下来本课题组探讨了氯化两面针碱诱导细胞凋亡的机制。本课题组首先检测了氯化两面针碱(NC)对凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3和p53表达影响。Western blot结果表明,10和20μM的氯化两面针碱(NC)处理细胞后,抗凋亡蛋白Bcl-2减低而促凋亡蛋白Bax表达增加。同时,激活的Caspase-9、Caspase-3和p53的表达上调。以上结果表明,氯化两面针碱通过诱导Bax的表达,进而激活Caspase-9、Caspase-3口p53,促进结直肠癌细胞的凋亡。5.ERK抑制剂协同氯化两面针碱促进细胞凋亡为进一步探讨氯化两面针碱抑制细胞生长、促进细胞凋亡的作用机制,本课题组将氯化两面针碱和ERK抑制剂U0126联合应用,发现细胞的增殖作用显著降低,表明ERK抑制剂显著提高氯化两面针碱(NC)诱导的抑制结直肠癌细胞活性的效果。观察3H胸苷吸收实验结果也得出类似结论,这也证实了阻断ERK活化可显著提高氯化两面针碱(NC)诱导的抑制结直肠癌细胞增殖效果。6.ERK抑制剂协同氯化两面针碱促进细胞凋亡的机理既然ERK抑制剂能够显著增强氯化两面针碱促进细胞凋亡,接下来本课题组联合应用U0126和氯化两面针碱处理细胞,检测了凋亡相关蛋白的表达。结果表明,用U0126抑制ERK活性可使NC诱导的Bax、caspase-3和caspase-9表达增加,并使Bcl-2表达下调,也进一步表明NC诱导的凋亡可能是ERK依赖的。结论1.氯化两面针碱可抑制结直肠癌细胞的生长和增殖；2.氯化两面针碱可诱导结直肠癌细胞的凋亡；3.氯化两面针碱通过抑制ERX的磷酸化来抑制结直肠癌细胞的生长和增殖。创新性1.首次发现了氯化两面针碱可抑制结直肠癌细胞的生长和增殖；2.首次发现了氯化两面针碱可诱导结直肠癌细胞的凋亡；3.首次发现了氯化两面针碱通过抑制ERK的磷酸化来抑制结直肠癌细胞的生长和增殖.局限性1.本研究中氯化两面针碱对结直肠癌的影响主要局限于体外实验,未进行相关动物模型实验；2.结直肠癌的发病机制是一个复杂的信号网络,本研究仅探究了氯化两面针碱与ERK、MAPK之间的联系而未探究与其他信号通路之间的联系。