传染性胰腺坏死病毒(Infectious Pancreas Necrosis Virus, IPNV)是引起鲑鳟鱼类传染性胰腺坏死病(Infectious pancreatic necrosis, IPN)的病原体。该病具有高度的接触性和传染性,IPN病毒主要危害鲑鳟鱼的幼鱼,死亡率高达90%以上,幸存的鱼终生带毒,是潜在的感染源。本病的主要病症是肝胰脏等实质器官出血、坏死。该病流行范围广、发病率高、死亡率高,每年给世界各地的渔业养殖带来巨大的经济损失,成为鱼类口岸检疫的第一类检疫对象。本研究利用乳酸杆菌选择性培养基MRS从健康的虹鳟肠道内分离乳酸杆菌,经革兰氏染色镜检,选择其中革兰氏阳性、不运动、无芽孢、杆状细菌做过氧化氢酶,氧化酶和硝酸盐还原活性实验均为阴性者进一步纯化。分离到的菌株用糖发酵反应管做基于生化反应的表型鉴定,鉴定结果与《伯杰名细菌分类手册》做比照后归类。为了进一步确认菌株的归类,设计了乳酸杆菌属16s rRNA特异性引物,扩增分离株的16s rRNA序列。测序结果表明,分离株均与植物乳杆菌序列同源性高度一致。虽然有许多学者报道分离出植物乳杆菌,但从虹鳟鱼肠道内分离出植物乳杆菌尚属首次报道。能否耐受一系列的环境压力,是一株菌能否被用作益生菌的重要参考指标。本实验中测试了筛选出的5株植物乳杆菌对pH、渗透压、胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶及温度的耐受性。5株菌在pH3.0,8%NaCl,0.5%胆盐,7g1-1胰蛋白酶以及10g1-1胃蛋白酶的条件下均能存活,但是在pH2.0时,5株菌均不能存活。温度耐受性试验表明,5株菌在60-C处理10min可以正常生长,但是在80℃或100℃时均不能存活。通过压力耐受试验,表明本实验从虹鳟肠道内分离筛选出的5株植物乳杆菌进入虹鳟鱼体内后,能够顺利通过胃肠道环境后存活下来。采用打孔法进行5植物乳杆菌对9株病原菌的抑菌活性,5株菌均能够抑制革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特菌(Listeria)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)以及革兰氏阴性细菌大肠杆菌(Colibacillus)、巴氏杆菌(Pasteurella)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的生长。乳酸菌可以作为一种很好的抗生素替代品来防治动物疾病的发生。用微生物药敏纸片(6mm)测试5株乳杆菌对8大类24种抗生素的药物敏感性,各菌株都表现出广谱抗生素耐药性。对链霉素(streptomycin)、庆大霉素(Gentamicin)、新霉素(Neomycin)、替考拉宁(Teicoplanin)、卡那霉素(Kanamycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、万古霉素(Vancomycin)和苯唑西林(oxacillin)敏感。所有试验菌株对万古霉素不敏感,对红霉素表现高度敏感,这与之前许多学者对植物乳杆菌的药敏性报道一致。本研究将虹鳟肠道分离的植物乳杆菌L1026、L1212及对照植物乳杆菌KLDS1.0344经荧光分子探针cFDA-SE标记后,灌喂虹鳟幼鱼。灌喂后1、2、4、6、10、15d,每组每次随机选取3尾虹鳟。解剖获得肠道粘膜冲洗液,用流式细胞仪检测有cFDA-SE荧光标记的细菌的残留率。1-4d,所有组残留的荧光标记菌数量均呈现下降；第6d,分离株L1026的荧光标记菌数显示上升,第10d下降,第15d又升高；分离株L1212在口胃插管后从6到第15d的荧光标记菌数持续上升；而对照组饲喂植物乳杆菌KLDS1.0344的荧光标记菌数6-15d显示持续下降。表明来自虹鳟鱼肠道内的植物乳杆菌能够更好的在虹鳟体内定植,且植物乳杆菌L1212有更强的定植能力。本研究将本实验室构建的pPG2-VP2-VP3质粒转化于虹鳟肠道分离的植物乳杆菌L1212中,经1%的乳糖诱导,经Western-blotting分析,以兔抗IPNV高免血清为一抗,HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗,DAB显色液显色后,在NC膜上看到明显的目的条带(约66KD)。使用海藻酸钠混合菌悬液之后包被颗粒饵料,检测添加和未添加海藻酸钠包被饲料后,菌体存活率,结果表明添加海藻酸钠的组菌落存活数较未添加组高；在饵料中添加1%、2.5%、5%的海藻酸钠,结果显示添加2.5%的海藻酸钠组乳杆菌成活率最高(2.6×106)；此外,将添加了海藻酸钠的菌悬液与颗粒饵料混合拌匀,分别置于20℃、32℃、37℃烘干,通过平板菌落计数,显示20℃烘干时菌落存活数最多(2.8×107)。将虹鳟幼鱼分为7组,投喂包被好pPG-2-VP2-VP3/L1212的饵料,同时设立饲喂宿主菌L1212、PBS以及模式菌株pPG612-VP2+3/L393对照组。于免疫第Od、31d、50d、63d采集虹鳟血清,检测血清特异性抗体IgM的变化；结果表明,饲喂重组菌的组均在免疫后第31d就出现了血清抗体。同时设立了间隔免疫组和连续免疫组,结果表明间隔免疫产生的抗体水平稍高于连续免疫组,组间差异不显著(p>0.05)；探讨免疫次数的结果表明,加强免疫后,抗体水平逐渐升高,第66d时达到最高,与对照组相比差异极显著(p<0.01),与免疫一次的组比组内差异显著(p<0.05)；用IPNV(sp株)对虹鳟幼鱼进行攻毒,结果显示：采用包被颗粒饵料的方法所制备的传染性胰腺坏死病毒VP2-VP3重组亚单位口服疫苗,在抵抗IPNV感染的过程中,产生了一定的保护作用。综合以上结果表明,本研究采用包被颗粒饵料的方法制备的重组pPG-2-VP2-VP3植物乳杆菌口服疫苗,对抵抗IPNV的感染有一定的保护作用,可以作为预防IPN的鱼用新型口服疫苗。