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结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)是引起人畜重大慢性传染性疾病-结核病(Tuberculosis, TB)的单一病原菌。研究表明，宿主本身遗传特质影响结核病易感性，在俄罗斯人群和中国人群中全基因组关联分析(Genome Wide Association Study，GWAS)表明ASAP1(ArfGAP with SH3 domain, ankyrin repeat and PH domain 1)多态性与结核病易感性显著相关，然而ASAP1如何影响结核病易感性还未有报道。本文从反式遗传学的角度在斑马鱼模型和巨噬细胞系THP1和Raw264.7中敲除或敲低ASAP1后分析宿主对于结核病易感性的变化，并进一步从吞噬细胞生理功能的角度探究了ASAP1影响宿主对结核病易感性的机制。主要研究结果如下：1.asap1基因敲除斑马鱼模型的构建
斑马鱼现已成为研究结核病的常见模式生物。本项目首先利用生物信息学分析了斑马鱼asap1a和asap1b基因，将斑马鱼asap1a和asap1b与人类ASAP1、小鼠的Asap1进行了染色体基因位点连锁性分析，并对斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白与人类、小鼠和大鼠的ASAP1蛋白进行了多重序列比对，通过进化树分析确定了斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白的进化位置。qRT-PCR方法检测发现斑马鱼asap1a和asap1b基因均系母性遗传控制，原位杂交显示两基因在斑马鱼体内通体表达，无组织特异性。应用基因编辑CRISPR/Cas9技术建立asap1a和asap1b基因敲除的斑马鱼，得到asap1a敲除突变斑马鱼3个品系，得到asap1b敲除突变斑马鱼3个品系，得到asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼1个品系，得到asap1a和asap1b双敲除突变且中性粒细胞荧光标记的斑马鱼1个品系。通过存活率分析发现，asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼在1-3天胚胎期死亡率明显增高，而asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼则无明显死亡率下降现象。通过qRT-PCR检测发现，asap1a单敲除突变斑马鱼中asap1b基因的表达量升高，在asap1b单敲除突变斑马鱼中未见asap1a基因的表达量有补偿性升高。另外，应用morpholino对斑马鱼asap1a和asap1b基因进行敲低，qRT-PCR和westernblotting证实两基因共敲低。第一部分结果表明通过morpholino和基因编辑的手段在斑马鱼中成功建立了asap1a和asap1b敲低或敲除的突变体。
2.应用斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型探讨Asap1影响巨噬细胞和中性粒细胞迁移能力进而影响宿主对结核病易感性关系
海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum, Mm)与结核分枝杆菌具有高度的同源性，是引起斑马鱼结核病的病原菌。斑马鱼的发育早期通体透明，能够通过应用荧光蛋白表达示踪细胞行为，所以在研究固有免疫相关吞噬细胞如巨噬细胞(macrophage,MΦ)和中性粒细胞(neutrophil)方面具有独特的可视化优势。本章首先在斑马鱼模型上系统研究Asap1对海鱼分枝杆菌易感性的影响，发现asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼对海鱼分枝杆菌易感性与野生型相比无明显的差异性，但asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼较野生型斑马鱼对海鱼分枝杆菌的感染能力增强。此结论与用morpholino敲低的asap1a和asap1b斑马鱼研究结果一致。在asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼中我们还发现，无论是尾部创口还是海鱼分枝杆菌感染后的定向趋化，巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力较之于野生型斑马鱼明显减弱。
3.利用人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7研究ASAP1与结核分枝杆菌易感性的关系
通过在人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7中建立敲低ASAP1的细胞模型，并经qRT-PCR与westernblotting验证敲低效率。其次在THP1和Raw264.7中发现敲低ASAP1的细胞较野生型细胞感染结核分枝杆菌的能力增强。Transwell实验表明敲低ASAP1引起了THP1和Raw264.7细胞对于结核分枝杆菌的迁移能力减慢，进一步验证了在斑马鱼中得到的Asap1可能影响结核病易感性的机制结论。在细胞模型中，我们还进一步探究了敲低ASAP1后细胞骨架发生的重塑现象，其中actinpuncta数量明显增加，并且相应的黏着斑蛋白Vinculin与桩蛋白Paxillin的聚合状态也发生了改变，这些都为解释ASAP1影响宿主抗结核分枝杆菌的机制提供了可能性。
综合发现，降低ASAP1表达水平增强了宿主对于结核分枝杆菌的感染程度，并且影响了巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力，推测这可能是ASAP1影响宿主结核病易感性的生物学机制。此课题的实施和完成将丰富宿主遗传基因影响结核病易感性的认识，对结核病的预防、早前筛查或培育抗结核病家畜具有一定科学意义和应用价值。
斑马鱼现已成为研究结核病的常见模式生物。本项目首先利用生物信息学分析了斑马鱼asap1a和asap1b基因，将斑马鱼asap1a和asap1b与人类ASAP1、小鼠的Asap1进行了染色体基因位点连锁性分析，并对斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白与人类、小鼠和大鼠的ASAP1蛋白进行了多重序列比对，通过进化树分析确定了斑马鱼Asap1a和Asap1b蛋白的进化位置。qRT-PCR方法检测发现斑马鱼asap1a和asap1b基因均系母性遗传控制，原位杂交显示两基因在斑马鱼体内通体表达，无组织特异性。应用基因编辑CRISPR/Cas9技术建立asap1a和asap1b基因敲除的斑马鱼，得到asap1a敲除突变斑马鱼3个品系，得到asap1b敲除突变斑马鱼3个品系，得到asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼1个品系，得到asap1a和asap1b双敲除突变且中性粒细胞荧光标记的斑马鱼1个品系。通过存活率分析发现，asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼在1-3天胚胎期死亡率明显增高，而asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼则无明显死亡率下降现象。通过qRT-PCR检测发现，asap1a单敲除突变斑马鱼中asap1b基因的表达量升高，在asap1b单敲除突变斑马鱼中未见asap1a基因的表达量有补偿性升高。另外，应用morpholino对斑马鱼asap1a和asap1b基因进行敲低，qRT-PCR和westernblotting证实两基因共敲低。第一部分结果表明通过morpholino和基因编辑的手段在斑马鱼中成功建立了asap1a和asap1b敲低或敲除的突变体。
2.应用斑马鱼-海鱼分枝杆菌模型探讨Asap1影响巨噬细胞和中性粒细胞迁移能力进而影响宿主对结核病易感性关系
海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum, Mm)与结核分枝杆菌具有高度的同源性，是引起斑马鱼结核病的病原菌。斑马鱼的发育早期通体透明，能够通过应用荧光蛋白表达示踪细胞行为，所以在研究固有免疫相关吞噬细胞如巨噬细胞(macrophage,MΦ)和中性粒细胞(neutrophil)方面具有独特的可视化优势。本章首先在斑马鱼模型上系统研究Asap1对海鱼分枝杆菌易感性的影响，发现asap1a和asap1b单基因敲除突变斑马鱼对海鱼分枝杆菌易感性与野生型相比无明显的差异性，但asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼较野生型斑马鱼对海鱼分枝杆菌的感染能力增强。此结论与用morpholino敲低的asap1a和asap1b斑马鱼研究结果一致。在asap1a和asap1b双敲除突变斑马鱼中我们还发现，无论是尾部创口还是海鱼分枝杆菌感染后的定向趋化，巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力较之于野生型斑马鱼明显减弱。
3.利用人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7研究ASAP1与结核分枝杆菌易感性的关系
通过在人单核巨噬细胞系THP1和鼠巨噬细胞系Raw264.7中建立敲低ASAP1的细胞模型，并经qRT-PCR与westernblotting验证敲低效率。其次在THP1和Raw264.7中发现敲低ASAP1的细胞较野生型细胞感染结核分枝杆菌的能力增强。Transwell实验表明敲低ASAP1引起了THP1和Raw264.7细胞对于结核分枝杆菌的迁移能力减慢，进一步验证了在斑马鱼中得到的Asap1可能影响结核病易感性的机制结论。在细胞模型中，我们还进一步探究了敲低ASAP1后细胞骨架发生的重塑现象，其中actinpuncta数量明显增加，并且相应的黏着斑蛋白Vinculin与桩蛋白Paxillin的聚合状态也发生了改变，这些都为解释ASAP1影响宿主抗结核分枝杆菌的机制提供了可能性。
综合发现，降低ASAP1表达水平增强了宿主对于结核分枝杆菌的感染程度，并且影响了巨噬细胞和中性粒细胞的迁移能力，推测这可能是ASAP1影响宿主结核病易感性的生物学机制。此课题的实施和完成将丰富宿主遗传基因影响结核病易感性的认识，对结核病的预防、早前筛查或培育抗结核病家畜具有一定科学意义和应用价值。